不同糖、脂含量日粮对翘嘴红鲌相关糖代谢酶的调节研究

论文摘要

翘嘴红鲌（Erythroculter ilishaeformis Bleeker）属鲤形目（Cypriniformes）、鲤科（Cyprinidae）、鲌亚科（Cultrinae）、红鲌属（Erythroculter Berg），为鲤科淡水经济鱼类。野生翘嘴红鲌是以活鱼为主食的凶猛肉食性鱼类，但在养殖全过程均可投喂人工饲料。为了探讨翘嘴红鲌利用饲料糖的能力，本文首先分离、克隆了翘嘴红鲌的糖代谢酶葡萄糖激酶（Glucokinase, GK, EC 2.7.1.2）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK, EC 4.1.1.32）以及葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase, G6Pase, EC 3.1.3.9）cDNA序列。随后选用720尾翘嘴红鲌，在日粮保持总能一致的条件下，分成无糖组（粗蛋白63.38％，粗脂肪9.13％）、中糖组（含可消化糖量14.45％，粗蛋白量50.14％，粗脂肪9.92％）、高糖组（含可消化糖量23.98％，粗蛋白量40.11％，粗脂肪9.94％）及高脂组（含可消化糖量14.98％，粗蛋白量40.88％，粗脂肪19.93％），每组设三个重复。饲养8周，然后测定禁食与摄食不同糖、脂含量日粮对翘嘴红鲌糖代谢酶GK、PEPCK以及G6Pase的基因表达水平和酶活性，同时测定了鱼体生长、肝体比、血液指标、肌肉营养成分等指标。1、翘嘴红鲌GK、PEPCK、G6Pase基因的克隆翘嘴红鲌GK全长cDNA共2054bp，包括63bp5′非翻译区，1428bp阅读框以及含Poly（A）信号AATAAA的563bp3′非翻译区[不包括Poly（A）]。阅读框共编码476个氨基酸，计算的分子量为53.74kDa。该序列含有在脊椎动物GK中保守的ATP和葡萄糖结合位点。与其他鱼GK的相似性高达86％-96％，和光滑爪蟾（Xenopus laevis）、人（Homosapiens）的GK的相似性也高达79％-80％。翘嘴红鲌PEPCK全长cDNA有2564bp，包括111bp 5′非翻译区，1911bp阅读框以及含Poly（A）信号AATAAA的542bp 3′非翻译区[不包括Poly（A）]。阅读框共编码636个氨基酸，计算的分子量为69.65kDa。该序列含有PEPCK特有的结合草酰乙酯的结构域以及与GTP三磷酸链和Mg2+结合的激酶1和2基序。与其他鱼PEPCK的相似性高达83％-96％，和光滑爪蟾、变形虫（Dictyostelium discoideum）等动物的相似性为50％-69％。翘嘴红鲌G6Pase催化亚单位全长cDNA有1900bp[不包括Poly（A）]，包括49bp 5′非翻译区，1068bp阅读框以及含Poly（A）信号AATAAA的778bp3′非翻译区(不包括Poly（A）]。阅读框共编码355个氨基酸，计算的分子量为39.89kDa。该序列与斑马鱼（Danio rerio）G6Pase的相似性高达95％，与鼠（Musmusculus）、狗（Canis familiaris）、人G6Pase的相似性为63％。和光滑爪蟾、金头鲷（Sparus aurata）和黑青斑河豚（Tetraodon nigroviridis）等G6Pase的相似性分别为69％、55％和76％。从分离到的翘嘴红鲌GK、PEPCK、G6Pase和其他动物相应序列相似性很高，因此，认为它们是有活性的。2、饲料中不同糖、脂水平对翘嘴红鲌生产性能的影响在日粮等能量的条件下，无糖组（高蛋白组）、中糖组、高糖组、高脂肪组饲料对翘嘴红鲌的死亡率、增重率、特定生长率、饵料系数、肥满度以及鱼体水分、脂肪及肝脏水分等没有显著（P＞0.05）影响，但相比之下高糖组增重率、特定生长率最低，饵料系数最高；无糖组（高蛋白组）是最低的。高糖组鱼的肝体比显著（P＜0.05）高于中糖组和高脂组，分别增加了28.81％和25.42％，高脂组脏体比比中糖组显著增加了56.73％。与无糖组相比，高糖组与高脂组鱼体肌肉粗蛋白、灰份分别显著（P＜0.05）降低了8.25％、12.88％与8.99％、9.07％；肝胰脏粗蛋白、粗脂肪分别显著（P＜0.05）增加了12.76％、44.88％与16.50％、9.07％。与中糖组相比，高糖组与高脂组肝胰脏粗蛋白、粗脂肪分别显著（P＜0.05）增加了4.48％、55.27％与7.93％、58.23％。无糖组（高蛋白组）鱼肌肉中的粗蛋白和灰份与高糖组和高脂组相比差异显著（P＜0.05），分别增加了8.25％、12.88％和8.99％、9.07％；肝胰脏除了水分不受饲料成分影响外（P＞0.05），无糖组（高蛋白组）、中糖组鱼肝胰脏的粗蛋白、粗脂肪含量显著低于高糖组，高脂组（P＜0.05），其他组之间没有显著影响。这表明单一营养成分过高可能会导致内脏营养成分过剩，引起脏体比和肝体比过大，同时也表明摄入过多的糖和脂肪可部分转化为肝胰脏的蛋白和脂肪储存。摄食后，血糖总体趋势呈先上升后趋于平缓，其中摄食后3h血糖和禁食48h时的血糖水平无显著差异（P＞0.05），3-6h呈大幅度上升，6h后上升趋于平缓，直到24h血糖水平仍明显高于（P＜0.05）禁食48h时的血糖水平，说明和大部分鱼类一样，摄食后翘嘴红鲌也有持续高血糖现象。比较禁食48h后的血糖量显示高糖组显著高于中糖组、无糖组（高蛋白组）、高脂组（P＜0.05），但中糖组、无糖组和高脂组之间差异不显著。摄食后6h，高糖组血糖达到最高值，但高脂组12h血糖值最高。说明饲料中糖水平高，鱼体血糖水平相对也高。摄食后血浆甘油三酯总体趋势呈先上升后下降，投料后3h达最高值。从禁食到投喂饲料后6h，高糖组血浆甘油三酯最高，其次是无糖组与高脂组，中糖组最低；6h到24h，则高脂组血浆甘油三酯最高，但与高糖组比较接近，其次是无糖组，中糖组仍最低。这说明饲料中的糖比脂更容易促进血浆甘油三酯的生成，但其最终结果都呈现饲料单一营养成分过高血浆甘油三酯含量也升高，但从禁食后各组血浆甘油三酯没明显差异，表明本试验饲料对鱼体血浆甘油三酯没有长期的影响。摄食后血浆胆固醇总体趋势除了无糖组（高蛋白组）变化不明显，而且最低外，其他各组都呈先上升后下降，在投喂饲料后3-6h达最高值，饲料糖、脂水平对翘嘴红鲌血浆胆固醇没影响。3、饲料中不同糖、脂水平对翘嘴红鲌GK、PEPcK、G6Pase基因表达的影响无糖组和中糖组GK基因的表达量比高糖组和高脂组明显低（P＜0.05），高糖组GK基因的表达量高峰出现在摄食后6h，而高脂组最高表达量则出现在12h，与对应组的血糖值是一致，这说明饲料中的高糖和高脂可以诱导翘嘴红鲌肝脏GK基因的表达，而且GK基因的调控在mRNA水平。翘嘴红鲌肝脏PEPCK基因的表达在中糖、高糖和高脂组摄食后变化不明显，但无糖组该基因的表达和其他各组有所不同，禁食、摄食后3h、6h之间无明显差异，12h达到最低，24h该基因的表达量达到最高。从投喂饲料后6h到12h，各组PEPCK基因表达量都很接近，无显著性的差异。在中糖组和高脂组之间，摄食后PEPCK基因的表达也没有显著性的差异，由此可知，饲料中的糖、脂肪对PEPCK基因的表达没有影响。在哺乳类动物中，PEPCK是以两种异构体形式出现，PEPCK-C（胞质型）和PEPCK-M（线粒体型），其中，仅PEPCK-C受营养和激素调控，而PEPCK-M几乎是固定不变的。本试验分离到的PEPCK基因的表达不受摄食及饲料中营养成份的影响，可能均是PEPCK-M型。翘嘴红鲌G6Pase中糖组基因表达量最低，并且摄食对该基因的表达没显著影响（P＞0.05），但无糖组和高脂组G6Pase基因的表达有上升趋势，但表达量变化没显著差异（P＞0.05），而高糖组在禁食时该基因的表达量明显高于其它各组（P＜0.05），并且在摄食后3h表达量下降，然后又持续上升到12h出现高峰，略高于禁食时的水平（P＞0.05），是无糖组禁食时表达量的4.86倍，24h时该基因的表达量降到低于禁食时的水平（P＜0.05），由此可见高糖会诱导该基因的表达。同时，高脂组明显大于中糖组（低脂），高脂对该基因的表达也有一定的诱导作用。从无糖组、中糖组和高脂组G6Pase基因表达量不受摄食的影响部分解释了鱼体摄食后持续高血糖的原因。4、饲料中不同糖、脂水平对翘嘴红鲌GK、PEPCK、G6Pase活性的影响摄食后翘嘴红鲌肝脏己糖激酶（Hexokinase, HK, EC 2.7.1.1）活性除了中糖组变化不明显，而且最低的外，其他各组都呈先上升后下降再上升的趋势，并于3-6h达最大值，但仅有无糖组（高蛋白组）44喂饲料后3h显著（P＜0.05）提高了肝脏HK活性。这表明摄食对HK的表达有诱导作用，但饲料中的糖、脂水平对HK没有显著影响，蛋白水平则有诱导作用。摄食后葡萄糖脱氢酶（Glucose Dehydrogenase, GDH, EC 1.1.1.47）活性总体也是先上升后下降，各组在3h达最高值后一直下降，在24h达最低，投喂饲料后3h肝脏GDH活性有显著提高（P＜0.05），但各组GDH活性无显著差异。摄食后GK活性总体也呈上升趋势，各组禁食，测不到GK活性，无糖组在投喂饲料后3h也还测不到GK酶活性。高糖组在投喂饲料后6-24h肝脏GK酶活性显著（P＜0.05）提高；各组GK酶活性相比，高糖组最高，这表明相比蛋白质和脂肪，糖更能诱导GK酶活性提高。摄食后肝脏PEPCK酶活性各组都呈急剧下降后趋于平缓，投喂饲料后6-24h显著（P＜0.05）降低肝脏PEPCK活性。各组之间PEPCK酶活性比较发现，从禁食到投喂饲料后3h，无糖组肝脏的PEPCK酶活性最大，高脂组最小，中糖组、高糖组相差不大；从投喂饲料后3h到投喂饲料后24h，无糖组肝脏PEPCK酶活性也是最大的，其次是高脂组，高糖组与中糖组相差不大，但差异均不显著。这表明禁食能诱导PEPCK活性的增加，投喂不同糖、脂水平饲料后对PEPCK活性影响不大。G6Pase活性总体趋势是各组都呈先下降后上升，各组在3h达最低，3-6h急剧升高后趋于平缓。从禁食到投喂饲料后3h，无糖组肝脏的G6Pase活性是最大的，其次是中糖组、高糖组，高脂组是最低的。从投喂饲料后3h到6h，高糖组肝脏的G6Pase活性相对较大，其他三组相差不大；从投喂饲料后6h到24h，高脂组肝脏的G6Pase活性相对较大，其次是中糖组与无糖组，高糖组是最低的。与禁食相比，无糖组在投喂饲料后3h显著降低了G6Pase活性，中糖组在投喂饲料后6-24h显著（P＜0.05）增加了G6PaSe活性，高糖组在投喂饲料后6h、24h显著（P＜0.05）增加了G6Pase活性，高脂组在投喂饲料后24h显著（P＜0.05）增加了G6Pase活性，其他差异不显著。这表明饲料中的糖、脂对G6Pase没有明显影响，但是随着时间的延长该基因的表达有增加趋势。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 文献综述
• 第一章 鱼类碳水化合物营养代谢研究
• 1 鱼类利用碳水化合物的研究
• 1.1 不同食性鱼类对碳水化合物利用研究
• 1.2 不同食性鱼类对碳水化合物的耐受性
• 2 鱼类糖代谢酶GK、PEPCK、G6Pase的研究
• 2.1 GK
• 2.2 PEPCK
• 2.3 G6Pase
• 3 饲料碳水化合物节约蛋白质效果
• 4 本研究的目的、意义以及研究内容
• 4.1 翘嘴红鲌的养殖地位及研究现状
• 4.2 本研究的主要内容
• 第二部分 试验研究
• 第二章 不同糖、脂含量日粮对翘嘴红鲌生长、鱼体成分的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 试验鱼种
• 1.2 试验日粮
• 1.3 饲养管理
• 1.4 样本采集
• 1.5 血液指标及肉质测定
• 1.6 相关指标计算公式
• 1.7 数据统计与分析
• 2 结果与分析
• 2.1 不同糖、脂含量日粮对翘嘴红鲌生长的影响
• 2.2 不同糖、脂含量日粮对翘嘴红鲌肝体比、脏体比及丰满度的影响
• 2.3 不同糖、脂含量日粮对翘嘴红鲌肌肉组成的影响
• 2.4 禁食与不同糖、脂含量日粮对翘嘴红鲌血液指标的影响
• 3 讨论
• 第三章 翘嘴红鲌GK cDNA分离及不同糖、脂含量日粮对GK基因的表达影响
• 1 材料与方法
• 1.1 试验鱼种
• 1.2 试验日粮
• 1.3 饲养管理
• 1.4 样本采集
• 1.5 试剂和仪器
• 1.6 引物设计
• 1.7 GK cDNA的分离
• 1.8 SYBR荧光定量RT-PCR法原理和方法
• 1.9 数据统计与分析
• 2 结果与分析
• 2.1 翘嘴红鲌GK基因的分离与克隆
• 2.2 翘嘴红鲌GK序列比较
• 2.3 翘嘴红鲌GK系统发育
• 2.4 禁食与摄食不同糖、脂日粮对GK基因表达的影响
• 3 讨论
• 第四章 翘嘴红鲌PEPCK cDNA分离及不同糖、脂含量日粮对PEPCK基因的表达影响
• 1 材料与方法
• 1.1 试验鱼种
• 1.2 试验日粮
• 1.3 饲养管理
• 1.4 样本采集
• 1.5 试剂和仪器
• 1.6 引物设计
• 1.7 PEPCK cDNA的分离
• 1.8 SYBR荧光定量RT-PCR法原理和方法
• 1.9 数据统计与分析
• 2 结果与分析
• 2.1 翘嘴红鲌PEPCK基因分离与克隆
• 2.2 翘嘴红鲌PEPCK序列比较
• 2.3 翘嘴红鲌PEPCK系统发育
• 2.4 禁食与摄食不同糖、脂日粮对PEPCK基因表达的影响
• 3 讨论
• 第五章 翘嘴红鲌G6Pase cDNA分离及不同糖、脂含量日粮对G6Pase基因的表达影响
• 1 材料与方法
• 1.1 试验鱼种
• 1.2 试验日粮
• 1.3 饲养管理
• 1.4 样本采集
• 1.5 试剂和仪器
• 1.6 引物设计
• 1.7 G6Pase cDNA的分离
• 1.8 SYBR荧光定量RT-PCR法原理和方法
• 1.9 数据统计与分析
• 2 结果与分析
• 2.1 翘嘴红鲌G6Pase基因分离与克隆
• 2.2 翘嘴红鲌G6Pase序列分析
• 2.3 翘嘴红鲌G6Pase系统发育
• 2.4 禁食与摄食不同糖、脂日粮对G6Pase基因表达的影响
• 3 讨论
• 第六章 不同糖、脂含量日粮对翘嘴红鲌GK、PEPCK、G6Pase活性的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 试验鱼种
• 1.2 试验日粮
• 1.3 饲养管理
• 1.4 样本采集
• 1.5 试剂和仪器
• 1.6 酶活性的测定
• 1.7 数据统计与分析
• 2 结果与分析
• 2.1 禁食与摄食不同糖、脂含量日粮对HK、GHD、GK活性的影响
• 2.2 禁食与摄食不同糖、脂含量日粮对肝脏PEPCK活性的影响
• 2.3 禁食与摄食不同糖、脂含量日粮对G6Pase活性的影响
• 3 讨论
• 全文讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 攻读博士学位期间发表的学术论文