鸡柔嫩艾美耳球虫体外模型的建立及其HSP70基因的克隆表达

论文摘要

鸡球虫病是由艾美耳属的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）等7种球虫单独或混合感染肠道不同部位所引起的一种肠道细胞内寄生性原虫病。（1）本研究利用鸡胚肠上皮细胞来替代鸡肾细胞,建立一种新型的鸡球虫体外细胞培养模型,因为球虫感染肠上皮细胞的条件和过程更加接近了鸡体自然感染状态。探讨了鸡胚肠上皮细胞体外分离培养的方法,结果显示,鸡胚肠上皮细胞,在37℃用Ⅰ型胶原酶分步消化70 min,低速离心后接种培养板,90 min后将未贴壁的细胞移至新的有胶原铺底的24孔培养板中,5%CO2 39.5℃,DMEM含5%胎牛血清的条件下培养,24～48 h细胞贴壁,7～8 d长成单层。（2）收集纯化的球虫子孢子,接种于适合球虫生长发育的鸡胚肠上皮原代细胞,采用这一细胞模型探索了E.tenella裂殖生殖阶段的发育情况,经试验确定了最适球虫繁殖的培养基和添加成分,建立了艾美耳球虫鸡胚肠上皮细胞培养适应株。结果表明,在细胞培养第8天时接种子孢子,子孢子在接种2 h后基本入侵细胞。换新的培养液重新培养,每12 h观察一次,3～4 d出现第一代裂殖体,5～7 d出现第二代裂殖体,7～8 d出现卵囊。该模型为球虫有关生理生化、免疫学、疫苗制备、药物效力试验等方面的研究工作,以及球虫病的防治研究开辟了新途径。（3）同时根据E.tenella HSP70基因（GenBank Locus:Z46965.1）设计特异性引物,以RT-PCR方法扩增了E. tenella广东株基因序列,并将其克隆至表达载体上,转入大肠埃希菌Rosetta菌,经IPTG诱导,实现其在宿主菌Rosetta中表达。先前表达的以pET-32a（+）为载体的HSP70蛋白多为包涵体形式存在于菌体细胞内,通过不断反复摸索表达条件,更换pMAL-c2X为表达载体,获得了可溶性的融合蛋白,并结合Amylose Resin层析获得较高浓度的目的蛋白。同时将HSP70基因插入pcDNA-6载体中,构建DNA疫苗表达载体,将构建好的质粒转染Vero细胞,结果表明,HSP70可以在细胞中成功表达。（4）用ELISA以及鸡只抗球虫感染动物实验,分别检测和统计了鸡只体内重组蛋白免疫后相应抗体水平和盲肠病变记分、测定克盲肠内容物卵囊数（OPG）、增重、综合抗球虫指数（ACI）等相关抗球虫感染指标,证明重组蛋白免疫后能在机体内产生一定的抗体水平和抗球虫感染保护力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 抗球虫药筛选方法的研究及寄生虫热激蛋白的研究进展
• 1.1 概述
• 1.2 抗球虫药筛选方法的研究
• 1.2.1 体内筛选
• 1.2.2 抗球虫药体内筛选程序及活性判定标准
• 1.2.3 体外筛选
• 1.2.4 细胞培养法筛选抗球虫剂程序
• 1.2.5 鸡胚筛选抗球虫药程序
• 1.2.6 总体评价
• 1.3 寄生虫应激蛋白的研究进展
• 1.3.1 热激蛋白的研究历史和分类
• 1.3.2 寄生虫热激蛋白的研究进展
• 实验研究
• 第二章 鸡胚肠上皮细胞的原代培养方法的建立
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验动物
• 2.1.2 主要仪器器材
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 主要试剂成分及含量
• 2.2 方法
• 2.2.1 细胞培养板处理
• 2.2.2 肠上皮细胞的分离
• 2.2.3 肠上皮细胞的消化
• 2.2.4 细胞生长和增殖
• 2.2.5 形态学观察及组织化学检查
• 2.3 结果
• 2.3.1 不同消化酶的分离效果
• 2.3.2 FCS 对鸡原代IEC 生长的影响
• 2 浓度对鸡原代IEC 生长的影响'>2.3.3 培养温度、CO₂ 浓度对鸡原代IEC 生长的影响
• 2.3.4 不同培养基对IEC 的影响
• 2.3.5 IEC 生长与形态
• 2.3.6 碱性磷酸酶活性显色结果
• 2.4 讨论
• 2.4.1 消化酶的选择
• 2.4.2 上皮细胞的纯化
• 2.4.3 生长基质
• 2.4.4 培养条件
• 2.5 小结
• 第三章 鸡球虫体外培养模型的建立
• 3.1 材料
• 3.1.1 主要仪器与试剂
• 3.1.2 实验所用虫株
• 3.2 方法
• 3.2.1 卵囊分离纯化与保存
• 3.2.2 制备球虫子孢子
• 3.2.3 柔嫩艾美耳球虫的体外培养
• 3.3 结果
• 3.3.1 不同培养基对子孢子的影响
• 3.3.2 培养基的pH
• 2 浓度'>3.3.3 培养温度、CO₂浓度
• 3.3.4 子孢子在鸡胚肠上皮细胞上的生长发育
• 3.4 讨论
• 第四章 鸡柔嫩艾美耳球虫HSP70 基因的克隆
• 4.1 材料
• 4.1.1 主要仪器
• 4.1.2 试验动物和饲料
• 4.1.3 菌株、载体
• 4.1.4 分子生物学试剂和试剂盒
• 4.1.5 培养基及配制
• 4.1.6 引物
• 4.1.7 主要试剂
• 2 法转化用材料'>4.1.8 CaCl₂法转化用材料
• 4.1.9 琼脂糖凝胶电泳所需材料
• 4.2 方法
• 4.2.1 子孢子的纯化
• 4.2.2 子孢子总RNA 的提取
• 4.2.3 RT-PCR 扩增E. tenella 基因
• 4.2.4 RT-PCR 产物的回收纯化
• 4.2.5 RT-PCR 产物与pGEM-T 的连接
• 2 法）'>4.2.6 连接产物转化E.coli DH5α（CaCl₂法）
• 4.2.7 转化克隆的PCR 鉴定
• 4.2.8 用E.Z.N.A 小量质粒制备试剂盒抽提PCR 阳性克隆的质粒
• 4.2.9 阳性克隆的序列测定及分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 E.tenella 开放阅读框HSP70 的RT-PCR 扩增结果
• 4.3.2 转化菌落的PCR 鉴定
• 4.3.3 HSP70 基因ORF 的测序结果
• 4.4 讨论
• 第五章 鸡柔嫩艾美耳球虫HSP70 在大肠埃希菌中的表达及DNA 疫苗表达载体构建
• 5.1 材料
• 5.1.1 主要仪器
• 5.1.2 菌株、载体
• 5.1.3 引物
• 5.1.4 常用分子生物学试剂和试剂盒
• 5.1.5 常规化学试剂
• 2 法转化所需材料'>5.1.6 CaCl₂法转化所需材料
• 5.1.7 培养基
• 5.1.8 SDS-PAGE 所需材料
• 5.1.9 免疫印迹所需材料
• 5.1.10 融合蛋白纯化所需材料
• 5.2 方法
• 5.2.1 HSP70 基因片段的扩增
• 5.2.2 载体的制备
• 5.2.3 pET-32a（+）、pMAL-c2X、pcDNA-6 与HSP70 的连接
• 2 法将连接产物转化入宿主细菌E.coli Rosetta（DE3）、E.coli JM109'>5.2.4 用CaCl₂ 法将连接产物转化入宿主细菌E.coli Rosetta（DE3）、E.coli JM109
• 5.2.5 转化克隆的PCR 鉴定
• 5.2.6 PCR 阳性克隆的酶切鉴定
• 5.2.7 HSP70 在E.coli Rosetta（DE3）的诱导表达
• 5.2.8 重组蛋白的大量表达和纯化
• 5.2.9 蛋白质浓度与纯度的检测
• 5.2.10 HSP70 在真核细胞的表达
• 5.3 结果
• 5.3.1 HSP70 基因片段的扩增结果
• 5.3.2 转化菌落的PCR 鉴定和质粒的酶切鉴定
• 5.3.3 HSP70 重组大肠埃希菌的诱导表达
• 5.3.4 HSP70 在细胞内的表达
• 5.3.5 HSP70 融合蛋白的亲和层析和Western blot 鉴定
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 第六章 鸡柔嫩艾美耳球虫HSP70 融合蛋白的免疫原性和保护性实验
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 所需仪器及材料
• 6.1.2 方法
• 6.2 重组柔嫩艾美耳球虫HSP70 免疫原性和保护性实验
• 6.2.1 试验动物及分组
• 6.2.2 试验设计
• 6.2.3 ELISA 检测鸡血清中的抗体
• 6.2.4 抗球虫效果的判定
• 6.3 结果
• 6.3.1 重组柔嫩艾美耳球虫HSP70 生物活性测定
• 6.3.2 免疫鸡血清效价的测定
• 6.3.3 鸡只增重变化
• 6.3.4 重组蛋白免疫对球虫感染的卵囊产量、盲肠病变的影响
• 6.3.5 重组蛋白免疫对球虫感染的综合保护效果
• 6.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录A 英汉缩写词表
• 附录B HSP70 测序结果
• 致谢
• 个人简介