游仆虫囊泡转运相关蛋白Rab-GTPase的基因克隆及功能分析

论文摘要

真核细胞被细胞内膜分隔成许多不同的区室,各区室之间通过复杂的囊泡运输和微管系统进行物质交换和信息传递。囊泡运输具有高度的选择性,Rab-G7Pase作为囊泡运输的分子开关,在囊泡运输的不同阶段调节囊泡特定的运输途径。纤毛虫是一类低等的单细胞真核生物,它的许多功能由细胞内特化的细胞器来完成,各细胞器之间通过囊泡转运进行物质交换。研究Rab蛋白在其中的功能,有助于了解真核细胞中囊泡定向运输机理。 本研究以八肋游仆虫（Euplotes octocarinatus）为材料,从其大核DNA中克隆得到16种Rab新基因,这些基因全长为767 bp,两端为端粒序列,开放读框为624 bp,编码207个氨基酸,Eorab基因序列中包含2～3个通用终止密码子TGA,在此编码半胱氨酸。这些基因拟编码的蛋白属于Rab蛋白家族,具有Rab家族保守的结构特征,命名为Eorab1b～Eorab1u,16种Rab基因同源性高达87.6～99.5%。 从游仆虫小核DNA中克隆得到了1种Rab新基因,该基因全长为784 bp,编码框亦为624 bp,命名为miEorab基因。 对来自大核和小核DNA的rab基因进行比较,发现miEorab基因中包含2个IESs（Internal Eliminated Sequences）序列,2个IESs的删除机制存在明显差异。 将Eorab1f中2个TGA突变为TGC。突变后的Eorab1f构建于原核表达载体pRSETc中。pRSETc-Eorab1f转化E.coli BL21（DE3）,经IPTG诱导、SDS-PAGE分析及Western blotting鉴定,目的蛋白获得表达。 表达产物经IMAC金属螯合亲和层析及Resource-Q阴离子交换层析纯化,获得电泳纯的蛋白。Brandford法检测表明纯化的目的蛋白产量为1.353 mg/L。Western blotting分析表明该蛋白为融合有6个

论文目录

• 目录
• CONTENTS
• 摘要
• ABSTRACT
• 略语表
• 第一章 文献综述
• 1 纤毛虫的特殊性
• 1.1 核的多态性
• 1.2 密码子使用的通用性与特殊性
• 1.3 纤毛虫作为实验动物的优势
• 2 Rab蛋白研究进展
• 2.1 Rab蛋白的结构
• 2.2 Rab蛋白的功能
• 2.3 Rab蛋白的进化
• 3 本工作的研究意义
• 参考文献
• 第二章 八肋游仆虫Rab基因的克隆及序列分析
• 1 材料
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 主要的酶及生化试剂
• 1.3 寡聚核苷酸
• 1.4 主要试剂的配制
• 1.5 主要实验仪器
• 2 方法
• 2.1 八肋游仆虫大核DNA中Rab基因的扩增
• 2.2 八肋游仆虫小核DNA中Rab基因的扩增
• 3 结果与讨论
• 3.1 Eorab的5’端部分序列的克隆
• 3.2 Eorab全序列的克隆
• 3.3 Eorab的序列分析
• 参考文献
• 第三章 八肋游仆虫Eorablf基因的突变、表达及纯化
• 1 材料
• 1.1 菌种与质粒
• 1.2 主要的酶及生化试剂
• 1.3 寡核苷酸
• 1.4 主要试剂的配制
• 1.5 主要实验仪器
• 2 方法
• 2.1 Eorablf基因的突变
• 2.2 Eorablf蛋白的表达
• 2.3 Eorablf蛋白的纯化
• 2.4 Western blotting印迹
• 3 结果与讨论
• 3.1 Eorablf基因序列分析
• 3.2 Eorablf基因的突变
• 3.3 Eorablf基因的表达
• 3.4 Eorablf基因的纯化
• 3.5 Western blotting印迹
• 参考文献
• 第四章 Anti-Eorablf的制备及在游仆虫中的定位
• 1 材料
• 1.1 实验动物及仪器
• 1.2 主要生化试剂
• 1.3 主要试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 抗原的制备
• 2.2 大鼠免疫
• 2.3 ELISA检测抗体的效价
• 2.4 八肋游仆虫总蛋白提取
• 2.5 八肋游仆虫蛋白提取物的免疫印迹
• 2.6 免疫荧光定位
• 3 结果与讨论
• 3.1 抗体制备及滴度测定
• 3.2 抗体的特异性检测
• 3.3 Eorablf的免疫荧光定位
• 参考文献
• 总结
• 附录Ⅰ 赭纤虫eRF1密码子识别功能结构域在大肠杆菌中的表达及其对宿主菌生长情况的影响
• 附录Ⅱ 个人简介
• 致谢