论文摘要
背景帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种常见的中老年人神经系统变性疾病,它以黑质致密部（SNpc）多巴胺能（DA）神经元的选择性丢失为特点,临床症状包括肌肉强直、静止性震颤、运动迟缓和姿态不稳等。帕金森病具有严重持续进展性、致残性以及目前治疗上的“无法治愈性”,严重威胁着人类的生命健康和生存质量。迄今为止,人们尚未完全认识清楚帕金森的发病机制,也还没有确切可靠的药物根治帕金森病。越来越多的体外、体内及人体实验研究指出细胞凋亡与帕金森病密切相关。因此,阐明帕金森病与细胞凋亡间的联系,阻止神经元细胞凋亡,从而减慢或阻止帕金森病进程显得尤为重要。50年代科学家使用电子显微镜观察了一位PD患者中脑的黑质部位,发现在黑质部位出现了一些类似凋亡的高密度的细胞核聚集特征。Mochizuki通过末端酶标记法（TUNEL）检测发现,黑质部位的多巴胺能神经细胞有0.6%-4.8%发生凋亡。显示帕金森与中脑多巴胺能神经元凋亡有密切关系。1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）可引起帕金森病的症状,故被广泛用来建立帕金森病细胞模型和动物模型,对帕金森的发病机制进行研究。目前研究表明,MPP+作为一种外源性毒物引起帕金森的机制是通过氧化应激机制和抑制线粒体电子呼吸链的复合体的活性,最终导致多巴胺神经元凋亡。作为第二信使的Ca2+在信号转导中具有重要作用,研究显示,无论是在早期还是晚期细胞内钙离子浓度升高都有促进细胞凋亡的作用。正常情况下,细胞质中的Ca2+浓度很低,而细胞外、线粒体和内质网中的Ca2+浓度要比细胞质中高,因而胞内Ca2+库的Ca2+释放和胞外Ca2+内流均能使细胞质内的Ca2+浓度大幅度增高,从而激活Ca2+依赖性激酶,引起一系列生化反应。控制细胞内钙稳态,维持相对稳定的胞浆内钙离子浓度（[Ca2+]。）,是神经元进行生理活动,维持生理功能的重要条件。胞内钙离子浓度的瞬变控制着一系列的生物过程,从增殖、肌肉收缩、分泌、基因表达、产生ATP到细胞死亡。因此,细胞内钙离子浓度要处于严格的调节控制之中,以维持细胞的重要生理功能。神经细胞内的Ca2+稳态的维持依赖于位于细胞膜上的Ca2+离子通道和位于细胞内Ca2+库的离子通道,线粒体是细胞钙的缓冲器,具有摄取、释放Ca2+以及调节胞浆Ca2+浓度的能力,50年前,人们就知道线粒体通过位于线粒体内膜上低亲和力、高选择性的离子通道线粒体钙单向转运体摄取Ca2+。使Ca2+在线粒体基质蓄积的驱动力是跨内膜膜电位（△Ψm）（内负）。线粒体通过钙单项转运体摄取Ca2+是依靠内负的膜电位而不是与ATP耦联也不共转运其他离子,但MCU的分子组成一直无法确定。直到2011年哈佛大学医学院和马萨诸塞综合医院研究人员通过查阅人类基因组项目数据库资料并结合实验分析,终于发现了驱动线粒体钙通道机制的关键蛋白CCDC109A（MCU）。MCU定位于线粒体内膜,由MICU1（调节伴侣）和MCU（成孔亚基）组成。尽管MCU与Ca2+低亲和力低,但当细胞受到刺激时,线粒体的基质Ca2+浓度能（[Ca2+]mt）迅速改变,这是由于线粒体与ER或质膜上的Ca2+通道相邻,线粒体低亲和力的摄钙系统暴露于高Ca2+浓度的微域,从而有利于线粒体的钙摄入。MCU是否在MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡中发挥作用,以及具体的作用、机制如何,尚未见文献报道。因此,本研究主要探讨MCU是否参与MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,以及它在其中扮演何种角色,为今后开发帕金森病的治疗药物提供理论依据。目的探索Mpp+诱导SH-SY5Y细胞的凋亡的机制；明确MCU是否参与Mpp+诱导的SH-SY5Y细胞的凋亡；探讨MCU通过何种机制参与Mpp+诱导的SH-SY5Y细胞的凋亡。方法在37℃C培养箱（5%C02、95%空气）内培养人神经母细胞瘤（SH-SY5Y）细胞。分别用不同浓度的Mpp+处理SH-SY5Y细胞不同时间后,MTT法测细胞存活率,选定药物作用时间和浓度作为建立帕金森病细胞模型的条件。用免疫印迹法检测不同浓度Mpp+对MCU蛋白表达的影响。观察MCU非特异性阻断剂（钌红（Ruthenium Red,RuR））、激活剂（精胺（Spermine,Sper））以及下调、过表达MCU等预处理对Mpp+促SH-SY5Y细胞凋亡的影响。激光共聚集显微镜检测下调、过表达MCU等预处理后Mpp+对SH-SY5Y细胞内质网游离钙浓度[Ca2+]ER及线粒体基质游离钙浓度[Ca2+]mt的影响；免疫印迹法检测下调、过表达MCU等预处理对GRP78蛋白表达的影响。结果1 MPP+导致SH-SY5Y细胞增殖活力下降,并具有剂量和时间反应关系Mpp+浓度在0-4mM内,作用24h和48h时,SH-SY5Y细胞存活率均随着浓度的增加逐渐降低,各个加药组细胞存活率与对照组相比,差异均有统计学意义（p<0.05）。不同浓度Mpp+作用24h的IC50约为1mmol/L,作用48h的IC50为0.1125mmol/L,参考文献,选择lmmol/L MPP+作用24h作为建模条件。2 MPP+可诱导SH-SY5Y细胞凋亡在光学显微镜下我们可看到正常SH-SY5Y细胞体积较大,多呈梭型,表面有少量较细长的突起,核大呈梭型；用1mmol/L的MPP+作用于SH-SY5Y细胞24h后,SH-SY5Y细胞核体积变小,细胞变圆。用终浓度5μg/ml Hoechst 33342染细胞核,荧光显微镜下可看到SH-SY5Y细胞的细胞核出现细胞固缩、破碎等凋亡的特征性表现。1mmol/L MPP+处理SH-SY5Y细胞24h后,线粒体膜电位下降；流式细胞仪测细胞凋亡率,结果显示,SH-SY5Y细胞凋亡率由4.6%±0.43%上升到11.3%±1.66%,差异具有统计学意义。3不同浓度MPP+对SH-SY5Y细胞MCU表达量的影响用不同浓度的MPP+处理SH-SY5Y细胞24h,观察MCU表达量的变化。结果显示,随着MPP+作用浓度升高,MCU蛋白的表达量逐渐下降,表明MPP+作用于SH-SY5Y细胞影响MCU蛋白的表达量。4阻断及激活MCU对MPP+诱导SH-SY5Y细胞凋亡率的影响通过前面实验,我们知道MPP+影响SH-SY5Y细胞MCU的表达量,那么MCU是否参与了MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡呢?我们采用MCU的阻断剂RuR （50μM）和激活剂Sper （100μM）分别预处理SH-SY5Y细胞30min后再加入MPP+作用24h,检测RR和Sper预处理对MPP+诱导SH-SY5Y细胞凋亡率的影响。我们发现,RuR+MPP+组与仅MPP+处理组相比,细胞胞凋亡率上升,差异具有统计学意义（p<0.05）; Sper+MPP+组与仅MPP+处理组相比,细胞凋亡率差异不具有统计学意义。结果表明,MCU的阻断剂RuR预处理导致MPP+诱导SH-SY5Y细胞凋亡率上升,而MCU的激活剂Sper预处理没有作用。为进一步验证MCU在MPP+诱导SH-SY5Y细胞凋亡中的作用,我们分别采用RNA干扰和过表达技术,下调和上调MCU的表达,免疫印迹法验证干扰效率。结果显示,实验中所设计的两对序列干扰效果均较好,MCU蛋白水平的表达量下调至50%左右；过表达后,MCU蛋白水平上调至175%。MCU下调或上调后,加入1mM MPP+处理24h,观察MCU下调或上调对MPP+诱导SH-SY5Y细胞凋亡的影响。结果显示,下调MCU导致MPP+诱导SH-SY5Y细胞凋亡率上升,而上调MCU导致MPP+诱导SH-SY5Y细胞凋亡率下降,差异具有统计学意义（p<0.05）。上述结果表明,MCU参与了MPP+诱导SH-SY5Y细胞的凋亡过程。5改变MCU蛋白表达对MPP+诱导[Ca2+]ER和[Ca2+]mt改变的影响lmmol/LMPP+处理导致SH-SY5Y细胞的[Ca2+]mt先下降后回升,干扰MCU能抑制MPP+导致的[Ca2+]mt的回升,使[Ca2+]mt持续维持在低水平；过表达MCU后再处理MPP+, [Ca2+]mt先短暂下降然后回升超过原来浓度水平,并维持在这一水平。lmmol/L MPP+处理导致SH-SY5Y细胞的[Ca2+]ER下降并维持在低浓度水平,干扰MCU后再用MPP+处理,[Ca2+]ER下降得更明显并维持在低浓度水平。过表达MCU能缓冲MPP+导致SH-SY5Y细胞[Ca2+]ER下降,使得[Ca2+]ER有所回升。6改变MCU蛋白表达对MPP+诱导的未折叠蛋白反应（UPR）的影响MPP+能导致UPR。我们通过干扰及过表达MCU,再用1mmol/L MPP+处理24h,收集全蛋白,用免疫印迹法检测,观察UPR标记蛋白GRP78/Bip的表达水平。结果表明,干扰MCU能促进MPP+诱导的GRP78蛋白表达上调,而过表达MCU则能降低GRP78蛋白表达水平。说明过表达MCU能减少UPR。结论本研究的结果显示,MPP+可诱导SH-SY5Y细胞的凋亡。MPP+处理可使SH-SY5Y细胞的MCU蛋白表达下降,阻断、干扰或激活、过表达MCU对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡分别起到协同和拮抗作用,这些结果说明作为线粒体内膜上重要的钙内流通道,MCU参与且能抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。其机制可能是通过缓解MPP+导致的[Ca2+]ER下降,维持内质网内钙稳态,从而减少UPR及保持正常的[Ca2+]mt、维持线粒体正常的生物能量学而发挥抗凋亡作用。