间充质干细胞纠正ITP Th1优势性表达和诱导免疫耐受机制的研究

论文摘要

目的:体外观察骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）对特发性血小板减少性紫癜（Idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP）患者CD4+CD25+T细胞比例以及T细胞分泌IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10功能的影响,并探讨上述两种调控作用之间的相关性,旨在探究MSCs调节ITP免疫平衡及诱导自身免疫耐受的机制,从而为ITP的临床治疗奠定初步的实验基础。研究方法:采用Ficoll分离骨髓单个核细胞,通过体外培养,扩增出MSCs,并通过形态学特征及流式细胞术检测其表面标志加以鉴定;通过Ficoll分离法和尼龙棉柱法获取正常人及ITP患者外周血T淋巴细胞,并应用流式细胞术检测T细胞中CD4+CD25+T细胞比例;MSCs经丝裂霉素MMC处理后按不同数量（2×103、1×104、5×104个细胞/孔）接种培养板作为基底层细胞,然后分别接种体外分离纯化的异体ITP及正常人T淋巴细胞,于2d、4d、6d后各自收集T淋巴细胞及培养上清,采用ELISA测定T细胞分泌的细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平;并用流式细胞术检测接种于骨髓MSCs的ITP患者CD4+CD25+T细胞比例。结果:分离培养的骨髓MSCs贴壁生长呈梭形,原代细胞呈集落分布,10d左右达到融合,传代细胞保持原代细胞的形态且增殖速度加快,6～7d即可达到融合;经流式细胞仪检测骨髓MSCs高表达CD29、CD105、CD166,低表达CD34、CD45、HLA-DR,3代以后的细胞中MSCs纯度达到95%以上;尼龙棉柱法分离的T淋巴细胞纯度可达到70%～80%左右。流式细胞仪检测结果,ITP患者外周血CD4+CD25+T细胞数量及CD4+CD25+/CD4+比值均明显低于正常对照组（P＜0.05）;在PHA作用下,数量＞1×104的骨髓MSCs与T淋巴细胞共培养4d后,与正常对照组相比,MSCs可显著上调ITP患者及正常人T淋巴细胞中CD4+CD25+T淋巴细胞比例及CD4+CD25+/CD4+比值（P＜0.05）,且随MSCs量的增加,作用增强（P＜0.05）。本研究未检测到骨髓MSCs本身分泌IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10。在PHA作用下,ITP患者T淋巴细胞分泌细胞因子IL-2、IFN-γ较正常人高（P＜0.05）,IL-4、IL-10较正常人低（P＜0.05）。骨髓MSCs与T淋巴细胞共培养后,与对照组相比,MSCs可显著抑制ITP患者或正常人T淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ（P＜0.05）,且随MSCs数量增加,抑制作用增强（P＜0.05）,共培养4d、6d其抑制作用明显强于2d（P＜0.05）;MSCs可促进ITP患者T淋巴细胞分泌IL-4、IL-10（P＜0.05）,且随MSCs数量增加,促进作用增强（P＜0.05）;MSCs对IL-4的作用与培养时间无显著相关性（P＞0.05）,但对IL-10促进作用随时间延长而增强（P＜0.05）;当MSCs数量＞1×104可促进正常人T淋巴细胞分泌IL-4（P＜0.05）,且随MSCs数量增加,促进作用增强（P＜0.05）,共培养4d、6d作用明显强于2d（P＜0.05）;MSCs可促进正常人T淋巴细胞分泌IL-10（P＜0.05）,且随MSCs数量增加,促进作用增强（P＜0.05）,共培养4d、6d其促进作用明显强于2d（P＜0.05）。体外骨髓MSCs对ITP患者T淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10具有调控作用,同时对CD4+CD25+T淋巴细胞具有上调作用,以上这种机制可使ITP患者的细胞因子及CD4+CD25+T淋巴细胞逐渐接近于正常人但仍达不到正常人水平（P＜0.05）。结论:①ITP患者存在T细胞分泌细胞因子的异常,表明ITP是一种Th1优势性的自身免疫性疾病,CD4+CD25+T细胞比例低于正常亦提示调节性T细胞在ITP发病中可能起重要作用。②MSCs在体外可调节ITP患者T淋巴细胞Th1/Th2反应平衡,并能上调CD4+CD25+调节性T细胞,进而诱导ITP患者免疫耐受形成,这一特性将为寻求免疫调节治疗新途径提供实验依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图表
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 学位论文评阅及答辩情况表