论文摘要
猪瘟（classic swine fever, CSF）是由猪瘟病毒（classic swine fever virus, CSFV）引起的一种猪高度接触性传染病,以高热、出血、淋巴细胞减少和免疫抑制为主要特征,是国际兽医局（OIE）所列的疫病目录必须通报的传染病之一。猪瘟兔化弱毒疫苗对我国猪瘟病毒的防控做出了重大贡献,已经在很大程度上控制了该病在我国的大规模流行。近年来,猪瘟多呈温和、慢性、非典型、隐性感染和持续性感染等新特征,同时多种原因引起的疫苗免疫失败时有发生,这些对猪瘟的预防提出了严峻的考验。除了疫苗免疫之外,人们一直在探索其它的防治手段。RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术发现为人类对抗病毒病提供了新的途径,被认为是最有潜力和应用价值的抗病毒方法之一,已广泛应用于病毒学研究中。随着转基因技术的发展,可以把有利于改善动物性状的外源基因添加到动物的基因组中,不受传统育种方法的限制,可以培育出常规育种难以产生的优良性状动物。将RNAi和转基因克隆技术结合起来进行抗病毒转基因育种,可以培育出携带有抗病基因的转基因动物,减少病毒病给带来的经济损失。本研究将这两种技术结合进行体外和体内抗猪瘟病毒研究,探索新的抗猪瘟病毒方法,为抗猪瘟转基因育种研究奠定了基础。本研究应用RNAi技术进行体外和体内抗猪瘟病毒研究。首先针对猪瘟病毒Npr0、NS2和NS3基因设计并化学合成了6个干扰靶点,在PK-15细胞上筛选高效抑制猪瘟病毒复制和增殖的干扰靶点,获得了3个针对猪瘟病毒NS3基因的干扰靶点siNS3-1、siNS3-2和：siNS3-3,抑制率分别高达85.5%、95.1%和84.7%,其中siNS3-2抑制效率最高,将用于进一步研究。应用siNS3-2干扰靶点以及实验室前期筛选的干扰靶点siN1、siN2和siNS5B,选择H1启动子,构建针对以上干扰靶点的猪瘟病毒特异性siRNA表达盒,将特异性siRNA表达盒插入到目标载体PGKneotpAlox2和pLox-siN 1中,构建了猪瘟病毒特异性siRNA单表达猪瘟病毒抗性基因（pLox-siN2、pLox-siNS3-2、pLox-siNS5B）和双表达猪瘟病毒抗性基因（pLox-siN1N2、pLox-siN1NS5B、pLox-siN]NS3-2）。选择四个不同的启动子（hU6、hH1、mU6和h7SK）构建四个独立的表达盒,插入到目标载体PGKneotpAlox2中,构建了猪瘟病毒特异性siRNA四表达猪瘟病毒抗性基因（pLox-siRNA4）。构建报告基因系统验证多表达猪瘟病毒抗性基因每一个siRNA都能得到有效表达,然后在PK-15细胞上进行了抑制猪瘟病毒增殖的研究,结果显示猪瘟病毒抗性基因pLox-siN1、pLox-siN2、pLox-siNS3-2、pLox-siNS5B、pLox-siN1N2、pLox-siN1NS5B、pLox-siN1NS3-2和pLox-siRNA4均能有效抑制猪瘟病毒的增殖（P<0.01）,抑制率分别高达84.8%、87.9%、87.0%、83.2%、90.1%、94.0%、91.8%和96.8%,多表达猪瘟病毒抗性基因抑制效果强于单表达猪瘟病毒抗性基因,四表达猪瘟病毒抗性基因抑制猪瘟病毒增殖效果显著强于单表达猪瘟病毒抗性基因（P<0.05）,多表达猪瘟病毒抗性基因抑制效果出现累加作用。为了研究构建的猪瘟病毒抗性基因在体内对猪瘟病毒的抑制效果,探索体内抗病毒方法,加快抗猪瘟转基因育种研究,合作单位应用这些猪瘟病毒抗性基因去掉载体的原核部分后构建了转基因克隆猪,我们对这些克隆猪分离原代细胞进行体外抗猪瘟病毒研究。0101号、0103号和0107号转基因克隆猪为双表达猪瘟病毒抗性基因siN1N2构建,2019号转基因克隆猪为四表达猪瘟病毒抗性基因siRNA4构建。提取转基因克隆猪基因组,通过PCR的方法确定猪瘟病毒抗性基因稳定整合到转基因克隆猪细胞的基因组中。分离转基因克隆猪的脐静脉血管内皮细胞、猪尾成纤维细胞、外周血白细胞和原代肾细胞,进行了抑制猪瘟病毒增殖的研究。结果显示0101号不同组织中分离的原代细胞均有抗猪瘟病毒感染与增殖的能力,2019号脐静脉血管内皮细胞具有抗猪瘟病毒感染与增殖的能力,0103号和0107号部分组织分离的原代细胞具有抗猪瘟病毒感染与增殖的能力。RNAi不能完全抑制猪瘟病毒增殖,为了研究是否因为病毒靶位点突变而导致的脱靶效应,本研究构建了稳定表达单表达猪瘟病毒抗性基因的PK-15细胞系,接种猪瘟病毒传10代,对病毒靶位点区域进行扩增并测序分析,结果发现本研究四个靶点构建的猪瘟病毒抗性基因不会引起因猪瘟病毒核酸碱基突变而产生脱靶效应。本研究进行了RNAi途径抗猪瘟病毒研究,探索了新的抗猪瘟病毒的方法,为RNAi技术应用于猪瘟的防控奠定了基础,也为研制抗猪瘟的转基因克隆猪提供了参考数据。