哈茨木霉高产几丁质酶菌株的筛选及其基因的克隆

论文摘要

木霉（ Trichoderma.SPP）属于半知菌类丛梗孢目,丛梗孢科真菌（Gloiosporae）是一种广泛存在于土壤、植物根际和叶面的腐生型真菌,对多种植物病原真菌具有拮抗作用。因而被当作为一种生防菌种进行使用,并引起了众多微生物学家和植物病害研究者的高度重视。一方面鉴于它能促进作物生长,另一方面因频繁的生化作用的不稳定性,迫使人们去探究原因,以促进木霉菌在植物生防领域和促作物生长上的开发利用,为实现促进木霉在生产应用上提供充分的生物学依据。几丁质是自然界广泛存在的生物多聚体,是构成大多数真菌细胞壁的主要成分,而有些微生物分泌的几丁质酶有降解几丁质的作用,而达到防治真菌的目的。很多年来,农业和林业上遇到的病害很大部分都是由昆虫和真菌引起的,不难发现,这两大类有个重要的共同点,就是其外壳都是由几丁质组成的。所以,在发现了化学农药对环境和人类造成的不可弥补的重大灾难后,人们把注意力朝向了生物防治,因而催化几丁质分解的主要酶——几丁质酶就自然地成了研究的重点。因此,不断去寻找筛选产几丁质酶的微生物,并纯化其所产几丁质酶,研究其性质、作用方式、作用效果及分子机理,以及转几丁质酶基因植物的研究发现,是目前生物防治研究中的一个新的热点。本项研究主要研究内容和结果如下:1.离子注入并筛选突变菌株:通过氮离子注入诱变哈茨木霉野生菌,再以透明圈法进行平板培养菌的初筛和复筛,DNS法测定液体培养菌的酶活,从中筛选出一株高产几丁质酶的菌株（编号为3.3）,命名为哈茨木霉菌株H-13。2.优化筛选木霉菌株生长条件:对所筛菌株进行单因素和正交试验发酵的条件优化。单因素分别是从培养基氮源、胶体几丁质浓度、发酵起始pH值、培养时间等方面进行,实验结果表明,添加1 %蛋白胨组的产酶量最高,1.0%胶体几丁质对菌体产几丁质酶的诱导性最强,初始pH 5.5、培养96h时产酶量较高;正交试验综合分析表明,哈茨木霉H-13接种于1%蛋白胨为氮源、0.5%胶体几丁质为碳源、初始pH 5.0的培养基,培养96h时,发酵液中的几丁质酶活可达到731.69 U/mL,高于单因素条件中的任一因素,比野生菌株酶活力提高1倍。3.对突变菌株几丁质酶基因克隆:哈茨木霉是重要的生防菌,对多种病原菌均有很好的拮抗作用,其作用之一就是产生多种细胞壁降解酶,尤其是42kD几丁质酶。根据GenBank上已有的42kD几丁质酶编码基因序列设计适宜的引物,通过PCR技术,从哈茨木霉H-13基因组DNA中扩增到相应序列,通过GenBank进行序列比对,发现该序列同已发表的其他Trichoderm harzianum 42kD几丁质酶序列具有99%的同源性,因此确定该序列为42kD几丁质酶编码基因,碱基序列比对表明在编码区内有11处碱基改变,导致6处氨基酸发生改变。4.进行了对所筛选菌株发酵产物的应用:在蚌埠怀远所进行了大棚蔬菜种植实验,其莴笋、番茄增长30%以上,水稻育秧状况表现出较对照组的明显旺盛。综上可知,本研究首次采用离子注入诱变的方法并获得高产几丁质酶的木霉菌株,表明此方法的可行性,对于其发酵产物对植物增长的事实,为木霉在促进植物生长和生物防治方面的研究提供了支持和依据,几丁质酶基因的成功克隆,为转基因植物的发展提供了理论依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 文献综述
• 1.1 几丁质酶的研究
• 1.1.1 微生物几丁质酶的研究
• 1.1.2 微生物几丁质酶应用方面研究
• 1.1.3 微生物几丁质酶分子生物学研究
• 1.2 离子束生物工程学研究进展
• 1.2.1 低能离子与生物体系相互作用的生物效应
• 1.2.2 离子束诱变在作物育种上的应用
• 1.2.3 离子束诱变在微生物育种上的应用
• 2 引言
• 2.1 课题立题及实验依据
• 2.2 主要研究内容
• 2.2.1 氮离子注入野生哈茨木霉菌
• 2.2.2 高产几丁质酶菌株的筛选
• 2.2.3 目标菌株发酵条件的单因素及正交试验研究
• 2.2.4 目标菌株发酵产物对植物生长的影响
• 2.2.5 目标菌株chi42 基因的克隆
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.2 仪器设备和试剂
• 3.2.1 实验试剂
• 3.2.2 实验器材
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 哈茨木霉离子束注入与高产几丁质酶菌株的筛选
• 3.3.2 几丁质酶基因的扩增
• 4 结果分析
• 4.1 氮离子注入剂量影响木霉孢子致死率
• 4.2 菌株的筛选
• 4.2.1 绘制葡萄糖标准曲线
• 4.3 哈茨木霉H-13 产酶条件研究
• 4.3.1 氮源对酶合成影响显著
• 4.3.2 几丁质浓度对几丁质酶合成的影响
• 4.3.3 培养时间在培养过程中对几丁质酶合成的影响
• 4.3.4 培养基初始pH 值对几丁质酶合成的影响
• 4.3.5 正交试验的结果分析
• 4.4 chi42 的扩增
• 4.4.1 哈茨木霉 H-13 总 DNA 的提取的检测结果
• 4.4.2 哈茨木霉 H-13 chi42 的pcr 扩增结果
• 4.4.3 chi42 纯化产物连接到 PMD18-T 载体之后通过转化后提取质粒并酶切验证的结果
• 4.4.4 测序结果
• 4.4.5 同源性比较结果
• 4.4.6 序列比对结果
• 5 讨论
• 5.1 氮离子注入诱变筛选
• 5.2 氮素来源对几丁质酶合成试剂的影响
• 5.3 胶态几丁质浓度对几丁质酶合成量的影响
• 5.4 发酵条件的优化
• 5.5 chi42 基因的改变
• 6 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 本论文特点及其创新性
• 6.3 下一步工作构想
• 参考文献
• 附录
• 作者简介
• 致谢