SSⅡ和SSⅢ基因克隆、反义融合基因表达载体构建及对马铃薯的转化

论文摘要

低糊化温度和抗冻融的淀粉在食品和化工领域具有广泛的用途。目前,生产上推广的马铃薯（Solanum tuberosum L.）品种,其淀粉糊化温度和冻融稳定性都不理想。为此,本研究利用反义RNA技术,调控马铃薯块茎中淀粉合成关键酶基因的表达,以改变淀粉的结构和组成,来培育具有淀粉糊化温度低和冻融稳定性好的加工型马铃薯品种,目前取得的结果有:1.采用RT-PCR技术,分别克隆到马铃薯可溶性淀粉合成酶SSII基因cDNA全长序列和SSIII基因cDNA第1940～3899碱基序列。序列分析表明,克隆的SSII基因cDNA片段为2320 bp,与公布的已知序列CDS同源性为96.80 %;克隆的SSIII基因cDNA部分片段的大小为1959 bp,与公布的第1940～3899碱基序列的同源性为93.81%。2.以含马铃薯块茎颗粒结合型淀粉合成酶GBSS基因5’侧翼片段的载体LS-9质粒DNA为模板,亚克隆了599 bp的GBSS基因5’侧翼序列;以含Patatin启动子的克隆载体LS-4质粒DNA为模板,亚克隆了968 bp的马铃薯Patatin启动子。3.利用分子生物学软件DNAStar对SSIII、SSII和GBSS基因的同源性进行了分析,从中各找出一段500～600 bp的非同源序列;通过“PCR一步法”将筛选出的3个片段融合在一起,克隆融合基因GS2S3。4.分别构建了GBSS基因5’侧翼序列和Patatin启动子驱动的反义GS2S3基因植物表达载体pBIGSG和pBIGSP,并导入农杆菌LBA4404中。5.以马铃薯试管苗茎段和叶片为受体材料,研究了预培养时间、农杆菌浓度、侵染时间、共培养时间及Kan选择压,初步建立了农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 缩略词表
• Ⅰ 引言
• Ⅱ 文献综述
• 1 马铃薯生产现状
• 1.1 世界马铃薯生产现状
• 1.2 中国马铃薯生产现状
• 1.3 马铃薯加工业发展状况
• 2 国内外马铃薯育种现状
• 2.1 国外马铃薯育种现状
• 2.2 国内马铃薯育种现状
• 3 基因工程技术在马铃薯育种中的应用
• 3.1 马铃薯抗病毒病基因工程
• 3.2 马铃薯抗细菌和真菌性病害的基因工程
• 3.3 马铃薯抗虫基因工程
• 3.4 马铃薯抗除草剂基因工程
• 3.5 马铃薯品质改良基因工程
• 4 马铃薯淀粉品质改良基因工程
• 4.1 淀粉合成机制
• 4.2 淀粉合成酶（SS）
• 5 糊化温度低、冻融稳定性好的淀粉的应用
• 5.1 支链淀粉和直链淀粉的特性
• 5.2 淀粉组分与淀粉糊化特性及冻融稳定性的关系
• 6 反义RNA 技术
• 6.1 反义RNA 的发现
• 6.2 反义RNA 作用的原理
• 7 植物基因工程中启动子研究
• 7.1 组成型启动子
• 7.2 组织特异性启动子
• 7.3 诱导型启动子
• 8 植物遗传转化技术在马铃薯基因工程中的应用
• 8.1 基因枪技术在植物遗传转化中的应用
• 8.2 农杆菌介导法进行植物遗传转化技术的研究
• 8.3 农杆菌介导遗传转化技术在马铃薯基因工程中的应用
• 9 本研究的目的和意义
• 10 研究技术路线
• Ⅲ 试验材料与方法
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌种和质粒
• 1.3 工具酶和试剂
• 1.4 培养基
• 2 方法
• 2.1 质粒DNA 的制备
• 2.2 根癌农杆菌质粒的制备
• 2.3 马铃薯块茎RNA 的提取方法
• 2.4 First-Strand cDNA 合成
• 3 基因克隆
• 3.1 马铃薯可溶性淀粉合成酶SSSⅢ的克隆
• 3.2 马铃薯可溶性淀粉合成酶SSSⅡ的克隆
• 3.3 马铃薯GBSS 基因5’侧翼序列序列鉴定
• 3.4 马铃薯块茎特异性启动子Patatin 序列的亚克隆
• 3.5 马铃薯GBSS 基因cDNA 序列的鉴定
• 2S₃ 的构建'>3.6 反义融合基因GS₂S₃的构建
• 4 植物表达载体的构建
• 4.1 GBSS 基因5’侧翼序列和Patatin 启动子驱动的GUS 基因植物表达载体的构建
• 4.2 GBSS 基因5’侧翼序列和 Patatin 启动子驱动的三价反义融合基因植物表达载体的构建
• 5 植物表达载体转化农杆菌
• 2S₃ 对马铃薯的转化'>6 反义融合基因GS₂S₃对马铃薯的转化
• 6.1 马铃薯遗传转化再生体系的建立
• 6.2 马铃薯组培苗的复壮
• 6.3 农杆菌工程菌菌液的准备
• 6.4 外植体的预培养
• 6.5 农杆菌对外植体的遗传转化
• Ⅳ 结果与分析
• 1 马铃薯可溶性淀粉合成酶 SSSⅢ基因cDNA 的克隆及序列分析
• 1.1 马铃薯块茎总RNA 的提取和琼脂糖凝胶电泳检测
• 1.2 马铃薯可溶性淀粉合成酶SSSⅢ的克隆及序列分析
• 2 马铃薯块茎淀粉合成酶SSⅡ基因cDNA 的克隆及序列分析
• 3 马铃薯淀粉合成酶GBSS 基因5’侧翼序列驱动的GUS 基因的植物表达载体的构建
• 3.1 马铃薯块茎淀粉合成酶GBSS 基因5’侧翼序列的亚克隆及鉴定
• 3.2 马铃薯淀粉合成酶GBSS 基因5’侧翼序列驱动的GUS 基因的植物表达载体的构建
• 4 马铃薯块茎特异启动子Patatin 驱动的GUS 基因的植物表达载体的构建
• 4.1 马铃薯块茎特异启动子Patatin 的亚克隆及鉴定
• 4.2 马铃薯块茎特异启动子Patatin 驱动的GUS 基因的植物表达载体的构建
• 5 GBSS 基因cDNA 的鉴定
• 2S₃ 的构建及植物表达载体的构建'>6 反义融合基因GS₂S₃的构建及植物表达载体的构建
• 6.1 对三个淀粉合成酶基因cDNA 非同源区段的分析
• 6.2 GBSS 基因和SSS ⅡcDNA 片段的融合结果
• 6.3 片段GBS-S2 和 SSⅢ基因cDNA 片段融合
• 2S₃ 植物表达载体pBIGSG 的构建'>7 GBSS 基因5’侧翼序列驱动的反义融合基因GS₂S₃ 植物表达载体pBIGSG 的构建
• 2S₃ 植物表达载体pBIGSP 的构建'>8 块茎特异性启动子Patatin 驱动的反义融合基因GS₂S₃ 植物表达载体pBIGSP 的构建
• 9 植物表达载体pBIGSG、pBIGSP 转化根癌农杆菌LBA4404
• 2S₃ 植物表达载体对马铃薯的遗传转化'>10 反义融合基因GS₂S₃植物表达载体对马铃薯的遗传转化
• 10.1 培养基的筛选
• 10.2 预培养时间对遗传转化的影响
• 10.3 农杆菌浓度、浸染时间及共培养时间对遗传转化的影响
• 讨论
• Ⅴ 结论
• Ⅵ 参考文献
• 图版
• 致谢
• 作者简介
• 导师简介