针对c-myc基因的小干扰RNA对急性淋巴细胞白血病细胞系Jurkat细胞增殖、凋亡的影响

论文摘要

研究背景:c-myc基因是调控细胞增殖与分化的癌基因,在急性白血病细胞株及急性白血病、恶性淋巴瘤患者的细胞中均出现高表达,是影响这些恶性肿瘤发生、发展的重要基因之一。RNA干扰（RNA interference）是许多生物体内的一种保守机制,是指一种双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）分子在mRNA水平关闭相应序列基因的表达使其沉默的过程,是一种序列特异性的转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing,PTGS）。其基本原理是dsRNA通过RNaseⅢ内切酶Dicer的作用产生21～23 nt有活性的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）,然后在细胞内形成RNA诱导沉默复合体（RNA induced silence complex,RISC）,RISC根据碱基互补以siRNA为模板特异地识别其同源基因mRNA,并对其进行递进式剪切,诱导序列特异性mRNA的降解,从而抑制基因表达。RNAi是新近发展起来的一种基因功能研究的新方法[1,2],因而得到迅速发展,目前已广泛应用于功能基因组和基因治疗的研究[3,4]。本研究选择c-myc表达较高且c-myc在细胞增殖、凋亡中起重要作用的Jurkat细胞[5,6]作为研究对象,观察c-myc siRNA对其增殖、凋亡的影响。目的:探讨c-myc小干扰RNA对急性淋巴细胞白血病细胞系Jurkat细胞的增殖、凋亡的影响及对c-myc基因、蛋白表达的影响。对白血病的基因治疗提供新方法和靶点。方法:针对c-myc mRNA的第1545-1565靶位点设计siRNA,采取化学合成法合成。合成的c-myc siRNA,经转染剂转染入Jurkat细胞,观察细胞形态学变化,应用四唑氮化合物（MTS）法绘制细胞生长曲线,细胞集落培养观察c-myc siRNA对Jurkat细胞增殖的影响,应用流式细胞术和TdT酶介导的末端缺失原位标记（TUNEL）法分析细胞的凋亡,RT-PCR及Western blot检测c-myc siRNA作用前后c-myc、hTERT基因的mRNA及蛋白表达水平的变化。结果:（1） c-myc siRNA能明显抑制Jurkat细胞的增殖,作用48小时的半数抑制浓度（IC50）约为75nM,MTS法检测c-myc siRNA对Jurkat细胞的生长有抑制作用,对克隆形成也有明显的抑制作用。（2） c-myc siRNA可引起Jurkat细胞凋亡,经流式细胞仪、TdT酶介导的末端缺失原位标记（TUNEL）法均检测出细胞凋亡,且随着作用时间的延长,凋亡率也逐渐上升。（3） c-myc siRNA可引起Jurkat细胞的c-myc、hTERT mRNA表达水平的降低。（4） c-myc siRNA可引起Jurkat细胞的c-myc、hTERT蛋白表达水平的降低。结论:化学合成法合成的c-myc siRNA能明显抑制Jurkat细胞的增殖与克隆形成,并可显著诱导Jurkat细胞发生凋亡。c-myc siRNA明显降低Jurkat细胞c-myc、hTERT基因的mRNA及蛋白表达水平,有望成为白血病靶向基因治疗的新工具。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与试剂
• 1.细胞株
• 2.主要试剂
• 3.仪器
• 第一部分 siRNA的化学合成
• 结果
• 第二部分 c-myc siRNA 对Jurkat 细胞的体外生物活性的影响
• 结果
• 讨论
• 1. RNAi 的作用机理
• 2. RNAi 技术在白血病相关基因研究中的应用
• 3. c-myc 基因在白血病发病机理中的作用
• 4. 端粒酶及 hTERT 基因在白血病发病机理中的作用
• 5. c-myc 基因与 hTERT 基因的相互关系
• 6. c-myc siRNA 对白血病细胞系 Jurkat 细胞体外生物活性的影响
• 小结
• 参考文献
• 综述
• 综述参考文献
• 致谢