基于IBDV为模型的dsRNA病毒反向遗传学研究

论文摘要

RNA病毒反向遗传学的发展极大地推动了RNA病毒的分子生物学研究和新型疫苗的开发。dsRNA病毒宿主范围广泛,对人或动物造成了重大危害和经济损失。但其反向遗传学的发展则远远落后于正链或负链RNA病毒。本研究以双RNA病毒科的传染性法氏囊病病毒（IBDV）为模式病毒,就dsRNA病毒的反向遗传进行探索性研究。首先克隆了IBDV ZJ2000株基因组B节段全长cDNA,ZJ2000株基因组B节段全长为2827bp,在GenBank登录号为DQ166818。ZJ2000株和TL2004株的体内、体外生物实验表明ZJ2000和TL2004株原代病毒均能直接适应CEF细胞,并引起明显的细胞病变,ZJ2000株在CEF细胞上的复制速度明显慢于弱毒株JDl株和HZ2株,TL2004株对9-11胚龄的SPF鸡胚和SPF鸡均有较强的致病性。对GenBank数据库中双RNA病毒进行生物信息学分析,在国内外首次发现双RNA病毒科中IBDV和IPNV各自的基因组重配现象,并在国内外首次提出双RNA病毒基因组重配模型。IBDV基因组重配毒株说明IBDV的毒力除VP2外,多重因素可以影响IBDV的毒力,尤其是B节段在决定毒力方面扮演着重要角色。以IBDV为模型,应用重叠PCR法在IBDV基因组A、B两节段的5’末端和3’末端分别引入具有自我剪切功能的核酶HamRz和HDV序列,分别克隆到PCI真核表达载体当中,构建真核载体PCI-ma和PCI-mb,建立并联式共转染的IBDV反向遗传系统,成功实现了以IBDV HZ2株为母毒的IBDV的遗传拯救。继而应用红色和绿色报告基因构建串连式表达载体,该载体含两个独立的转录单位,结果显示报告基因串连式载体在同一靶细胞内的共表达情况明显优于两报告基因共转染在同一细胞内的表达效率。将IBDV基因组A、B节段以串连的方式构建到同一载体当中,该载体含两个独立的转录单位,载体命名为PCI-mab。将PCI-mab转染细胞进行病毒拯救,其拯救效率比并联式拯救效率提高100倍。以IBDV为模型,应用PCR法在IBDV基因组A、B两节段的5’末端和3’末端分别引入T7启动子和核酶HDV序列,构建T7启动子控制下的IBDV感染性载体PT-mA和PT-mB.在脂质体介导下将PT-mA和PT-mB共转染经痘病毒vTF7-3预先感染1h的Vero细胞,建立了基于辅助病毒表达T7 RNA聚合酶的IBDV反向遗传系统,成功实现了以IBDV HZ2株为母毒的IBDV的遗传拯救。以IBDV为模型,成功实现了不依赖辅助病毒、借助表达T7 RNA聚合酶的细胞系的dsRNA病毒的遗传拯救。分别从原核表达菌株BL21工程菌基因组和痘病毒VTF7-3基因组中克隆T7 RNA聚合酶基因,结果显示克隆的基因同源性为100%。将T7 RNA聚合酶基因构建到逆转录病毒载体pLPCX中,经包装细胞PT67包装后得到具有感染性而不具有自我复制功能的假病毒颗粒JVT7,再将假病毒颗粒JVT7感染Vero细胞,经嘌呤霉素筛杀,建立了表达T7 RNA聚合酶的细胞系V-T7,并用此细胞系实现了IBDV的遗传拯救。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 dsRNA病毒简介
• 1.1 dsRNA病毒的概念
• 1.2 dsRNA病毒中重要代表病毒简介
• 2 反向遗传学研究
• 2.1 病毒学研究方法发展简史
• 2.2 RNA病毒反向遗传学的概念
• 2.3 RNA病毒反向遗传学一般操作方法
• 2.4 RNA病毒反向遗传系统发展简史
• 2.5 正、负链RNA病毒反向遗传系统
• 2.6 dsRNA病毒反向遗传系统
• 2.7 反向遗传学的应用
• 2.8 病毒拯救效率的影响因素
• 3 本课题的研究目的及意义
• 4 研究内容及技术路线
• 第二章 传染性法氏囊病病毒（ZJ2000株）基因组B节段全长的克隆及ZJ2000和TL2004株生物学实验
• 摘要
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 病毒毒株及鸡胚
• 2.2 载体、菌株及分子生物学试剂
• 2.3 ZJ2000株病毒基因组dsRNA的提取
• 2.4 长距离RT-PCR一步法扩增基因组B节段全长
• 2.5 cDNA克隆、鉴定及序列测定
• 2.6 IBDV ZJ2000株体外生物学实验
• 2.7 IBDV TL2004株体内、体外生物学实验
• 3 结果
• 3.1 IBDV ZJ2000株基因组B节段cDNA的克隆、鉴定及序列测定
• 3.2 ZJ2000株的体外生物学实验
• 3.3 IBDV TL2004株体外、体外生物学实验
• 4 讨论
• 第三章 双RNA病毒科基因组生物信息学分析
• 摘要
• 1 引言
• 2 所用生物信息学软件
• 3 序列分析
• 3.1 A节段分析
• 3.2 B节段分析
• 4 IBDV毒力变异的分子基础及进化特征
• 4.1 ZJ2000株是一个新出现的基因组重配毒株
• 4.2 影响ZJ2000株的毒力因素
• 4.3 自然界中基因组重配发生的机理及概率
• 5 水生动物双RNA病毒基因组重配分析
• 6 基因组重配现象在RNA病毒进化中的作用分析
• 7 小结
• 第四章 基于RNA聚合酶Ⅱ的双质粒共转染传染性法氏囊病病毒反向遗传系统的建立
• 摘要
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 载体、菌株及分子生物学试剂
• 2.2 预构建的PCI-ma和PCI-mb载体结构图及所用引物
• 2.3 重叠PCR法在IBDV基因组A、B节段分别引入核酶序列
• 2.4 感染性真核表达载体的构建
• 2.5 病毒拯救
• 2.6 病毒检测
• 3 结果
• 3.1 重叠PCR法扩增基因组A、B节段全长
• 3.2 感染性真核表达载体的PCR及酶切鉴定结果
• 3.3 感染性真核表达载体的测序结果
• 3.4 病毒拯救
• 4 讨论
• 第五章 串连式IBDV病毒反向遗传系统的建立
• 摘要
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 载体、菌株及分子生物学试剂
• 2.2 串联式报告基因载体pDsCMV-R-G的构建及表达
• 2.3 串连式IBDV病毒遗传拯救
• 3 结果
• 3.1 pCMV-G载体的构建与鉴定
• 3.2 pDsCMV-R-G载体的构建与鉴定
• 3.3 pDsCMV-R-G在细胞内的表达
• 3.4 PCR法扩增PCI-mblined
• 3.5 过渡载体PCI-mmb的鉴定
• 3.6 感染性真核表达载体pDsCMV-A-B的鉴定
• 3.7 病毒拯救及拯救效率比较
• 4 讨论
• 第六章 基于辅助病毒表达T7 RNA聚合酶的传染性法氏囊病病毒反向遗传系统的建立
• 摘要
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 载体、菌株及分子生物学试剂
• 2.2 预构建PT-R报告基因载体图谱及引物设计
• 2.3 T7启动子控制的红色荧光报告基因载体的构建
• 2.4 痘病毒vTF7-3在Vero细胞内表达T7 RNA聚合酶活性的检测
• 2.5 T7启动子控制的IBDV感染性载体的构建
• 2.6 病毒拯救
• 2.7 病毒检测
• 3 结果
• 3.1 PT-R报告基因载体的构建
• 3.2 PT-R在Vero细胞内表达情况检测
• 3.3 IBDV基因组5'末端和3'末端引入T7启动子和HDV序列
• 3.4 感染性载体的构建
• 3.5 病毒拯救
• 4 讨论
• 第七章 T7 RNA聚合酶基因的克隆、稳定表达T7 RNA聚合酶细胞系的建立及IBDV的遗传拯救
• 摘要
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 载体、菌株及分子生物学试剂
• 2.2 T7 RNA聚合酶基因的克隆
• 2.3 T7 RNA聚合酶基因的序列分析
• 2.4 T7 RNA聚合酶基因逆转录病毒载体的构建
• 2.5 感染性逆转录病毒颗粒的获取
• 2.6 表达T7 RNA聚合酶Vero细胞抗性克隆的筛杀
• 2.7 基于V-T7细胞系的IBDV拯救
• 2.8 病毒拯救效率比较
• 3 结果
• 3.1 T7 RNA聚合酶基因的克隆及其序列分析
• 3.2 T7 RNA聚合酶基因逆转录病毒表达载体的构建
• 3.3 稳定表达T7 RNA聚合酶V-T7细胞系的筛选
• 3.4 稳定表达T7 RNA聚合酶细胞系的鉴定
• 3.5 病毒拯救及拯救效率比较
• 4 讨论
• 第八章 总结与展望
• 1. 研究论文主要结论及创新点
• 2 研究展望
• 参考文献
• 附录
• 附录图1
• 附录图2
• 附录图3
• 作者简历
• 在读期间所获荣誉及奖励
• 攻读博士学位期间发表的学术论文
• 参加国际会议
• 申请国家发明专利
• 攻读博士学位期间参加的科研项目