UXT结合蛋白VHL调控AR通路的分子机制研究

论文摘要

VHL （von Hippel-Lindau）疾病是一种罕见的常染色体显性遗传病,其发病率为1/3.6万,平均发病年龄为26.3-30.9岁。VHL作为一个肿瘤抑制子,缺失或者失活将会导致一系列的肿瘤发生。VHL与Cul-2、Elongin B、Elongin C和Rbx1在体内形成一个CRL E3泛素连接酶复合物促进底物蛋白如HIF1α发生蛋白酶体方式的降解。目前发现VHL缺失或者突变导致肿瘤发生是因为HIF1α不能被降解,而在细胞质中积累并移位到细胞核中与HIF1β组成异源二聚体,成为一个有功能的转录因子激活一些基因的转录,如GLUT-1、PDGF、CA-IX、 VEGF和TGFα等。作为E3泛素连接酶中的一个组分,VHL可以促进HIF1α、 SUMO修饰的HIF-2α、hsRPB7、β-catenin、Dv12、STRA13和ER-a发生泛素化降解。虽然现在找到了一些VHL调控的靶蛋白,但是作为在肿瘤发生过程中起着重要作用并广泛表达的蛋白质,其它受VHL调控的底物仍然有待发现。本研究通过建立一种改进的酵母双杂交方法来寻找新的VHL调控的靶蛋白。主要结果如下：1.建立了一种改进的酵母双杂交方法通过改进文库扩增方式,转化和筛选的过程,建立了一种改进的酵母双杂交的方法,克服了传统酵母双杂交方法操作复杂、难以寻找低丰度的基因所表达蛋白质的互作、假阳性和假阴性多的缺点。2.用建立的酵母双杂交方法筛选与VHL相互作用的蛋白质通过酵母双杂交筛选,以鼠源的VHL为“诱饵”,在人的胎脑cDNA文库中初步筛选到了25个与之互作的蛋白质。通过回转验证发现4个与VHL互作比较强,分别是Dv12、UXT、PFDN5和RANBP9,并对VHL-Dv12和UXT-VHL进行了深入研究。3.VHL促进Dvl2发生UB-K48-位连接的泛素化通过详细的泛素化分析,结果显示,VHL可以促进Dvl2的301位赖氨酸残基与K48-位连接的多泛素化链连接从而导致Dvl2发生泛素化依赖的蛋白酶体降解。4.VHL与UXT互作调控AR的转录激活活性通过酵母双杂交筛选得到的与VHL互作的蛋白质UXT是雄激素受体AR的辅因子。GST pull-down.免疫共沉淀以及核质分离实验表明UXT与VHL在细胞核中相互作用。VHL能直接与AR的DBD和Hinge区域结合,诱导AR发生非典型的泛素化。在有雄激素DHT刺激的条件下,VHL与AR互作能够提高AR的转录激活活性。通过RNAi手段降低细胞中的VHL表达水平,AR的泛素化水平和转录激活活性都随之降低。研究结果表明,VHL和UXT之间的相互作用以及VHL诱导的AR的泛素化能够调控AR的转录激活活性。

论文目录

• 本论文的创新点
• 中文摘要
• Abstract
• 常用缩写
• 第一章 前言
• 1. VHL研究概况
• 1.1 VHL相关疾病
• 1.2 VHL疾病的临床分类及其致病原因
• 1.3 VHL基因及其蛋白质的结构
• 1.4 VHL的细胞定位
• 1.5 VHL蛋白质的转录后修饰
• 1.6 VHL蛋白质的功能
• 2. VHL与WNT通路
• 3. VHL疾病的治疗
• 4. 本论文研究的目的和意义
• 第二章 一种改进的酵母双杂交方法的建立
• 1. 酵母双杂交方法介绍
• 2. 材料
• 2.1 质粒和菌种
• 2.2 主要试剂和试剂盒
• 2.3 试剂配方
• 3. 方法
• 3.1 bait pGBKT7-VHL构建
• 3.2 用pGBKT7-VHL在人脑cDNA文库中筛选相互作用的蛋白质
• 4. 结果
• 4.1 pGBKT7-VHL的构建
• 4.2 酵母双杂交筛选到的猎物的PCR验证
• 4.3 酵母双杂交筛选到的猎物对应的基因及其蛋白质区段
• 4.4 酵母双杂交筛选到的猎物回转验证
• 5. 讨论
• 5.1 用酵母双杂交筛选VHL互作蛋白的原因以及新构建的酵母双杂交系统的优缺点
• 5.2 对筛到的猎物与VHL互作的功能分析
• 第三章 VHL促进Dvl2 K301位发生K48位泛素化降解
• 1. WNT通路与DVL关系的介绍
• 1.1 WNT通路介绍
• 1.2 Dvl蛋白质的结构
• 1.3 Dvl蛋白质的功能
• 1.4 Dvl的磷酸化调控
• 1.5 Dvl的稳定性调控
• 1.6 Dvl缺失小鼠模型
• 2. 材料
• 2.1 菌种和细胞系
• 2.2 抗体、转染试剂和化学试剂
• 2.3 引物和载体构建
• 3. 方法
• 3.1 构建定点突变和缺失突变以及干涉载体反向PCR的具体操作
• 3.2 哺乳动物细胞系的传代培养
• 3.3 细胞冻存
• 3.4 细胞复苏
• 3.5 哺乳动物细胞的转染（表达用）
• 3.6 免疫共沉淀实验
• 3.7 蛋白质电泳、Westernblot和泛素化检测
• 3.8 报告基因分析
• 4. 结果
• 4.1 VHL介导Dvl2的K301发生泛素分子K48位的泛素化而不是K63位的泛素化
• 4.2 VHL通过下调Dvl2的表达来降低LEF启动子活性
• 5. 讨论
• 第四章 VHL调控AR通路的分子机制
• 1. UXT蛋白质的研究概况
• 1.1 雄性激素受体（AR）
• 1.2 AR与前列腺癌
• 1.3 蛋白质的核质穿梭
• 2. 材料
• 2.1 菌种和细胞系
• 2.2 抗体、转染试剂和化学试剂
• 2.3 试剂配方
• 2.4 引物和载体构建
• 3. 方法
• 3.1 常规的分子和细胞操作
• 3.2 GST Pulldown实验
• 3.3 免疫荧光定位分析
• 3.4 细胞核质分离实验
• 4. 结果
• 4.1 酵母双杂交验证UXT与VHL互作
• 4.2 UXT与VHL在体外和体内的相互作用
• 4.3 VHL与UXT互作的区域的确定
• 4.4 大转录本UXT-V1和小转录本与VHL的互作
• 4.5 大转录本UXT-V1和小转录本与AR互作,并不依赖于配体雄激素DHT
• 4.6 VHL与雄激素受体AR互作
• 4.7 VHL诱导AR泛素化
• 4.8 VHL调控AR转录激活活性
• 5. 讨论
• 研究总结
• 参考文献
• 博士期间发表文章
• 致谢