苦荞芽期总黄酮含量及其合成主要关键酶和MYB转录因子基因表达分析

论文摘要

黄酮类化合物广泛存在于植物界,主要包括黄酮醇、黄酮、查尔酮、黄烷酮和花色素等。研究表明,此类化合物是植物组织主要的呈色因子,也具有抗氧化、抗癌症等多种药理活性,是目前研究颇热的一类植物次生代谢产物。苦荞（Fagopyrum tataricum）为蓼科双子叶植物,不仅营养丰富,而且富含黄酮类物质,是一类药食两用植物。苦荞中主要的黄酮类化合物为芦丁,其生物合成受到其合成途径中关键酶、转录因子以及环境因素的共同作用。其中,苯丙氨酸解氨酶PAL是苯丙烷代谢途径的第一个关键酶,查尔酮异构酶CHI是黄酮合成途径的限速酶,黄酮醇合酶FLS是黄酮醇（芦丁）支路的第一个关键酶。MYB转录因子是对该途径关键酶转录具有调控作用的转录因子,是影响黄酮生物合成的重要内在因素。本研究测定了苦荞芽期胚轴和子叶中总黄酮含量,分析了上述关键酶基因和MYB转录因子转录水平的表达情况,为初步明细苦荞芽期黄酮积累的分子机制提供参考。主要研究结果如下。1.采用甲醇抽提法提取苦荞种子萌发后第6-10d胚轴和子叶中的总黄酮,并以AlCl3法测定总黄酮含量。结果表明子叶和胚轴中总黄酮含量差异极显著（P<0.01）,子叶中总黄酮含量在4.58%-5.54%之间,且随芽期递增；胚轴芽期第6-7d总黄酮含量从0.93%下降至0.68%,并稳定在0.7%左右。2.以苦荞持家基因组蛋白编码基因H3为内参基因,采用半定量RT-PCR技术检测关键酶基因Pal、Chi和Fls在苦荞萌芽期胚轴和子叶中的表达。结果表明,在子叶中,Pal和Chi的表达均在第7d出现一个峰值,分别为140%和120%,随后下降至25%和20%左右；Fls的表达水平从150%逐渐升高至第8d的375%,随后逐渐下降至130%。在胚轴中,Pal表达趋势与其在子叶中相似,但表达量最高达210%,最低约110%；Chi表达则相对稳定,在40%-70%波动；而Fls在第6d-7d维持在220%左右,至第8d急剧下降至75%左右,随后又逐渐下降,至第10d降至50%。可见,这些关键酶基因在苦荞芽期的表达存在组织差异。3.以苦荞持家基因组蛋白编码基因H3为内参基因,采用半定量RT-PCR技术检测转录因子基因FtMyb1、FtMyb2和FtMyb3在苦荞萌芽期子叶和胚轴中的表达。子叶中FtMyb1在芽期第8d表达减弱至最低5%,随后逐渐增强；FtMyb2在芽期第6d-8d相对表达量保持在40%左右,随后迅速减弱至约5%;FtMyb3在芽期第7d表达减弱至最低40%,随后逐渐上升至90%。胚轴中FtMyb1表达随芽期逐渐降低至7.5%,在第9d上升至27%,第10d又下降至5%左右；FtMyb2在芽期第8d表达量降低至5%,随后逐渐增强至70%左右；FtMyb3在芽期第6d-7d的表达略有下降,随后逐渐升高至95%。分析表明,这些MYB转录因子基因在苦荞芽期的表达存在组织差异。4.采用SPSS13.0统计软件单因素方差分析和Duncan多重比较法对子叶和胚轴中上述6个基因的表达水平进行统计分析。结果表明,子叶中Fls基因与其他5个基因的表达差异显著（P<0.05）,其他基因之间的表达差异不显著（P>0.05）。胚轴中Pal的表达水平与Chi以及FtMyb1、FtMyb2、FtMyb3的表达水平差异显著（P<0.05）；Fls与FtMyb1的表达水平差异显著（P<0.05）,其它基因间彼此差异不显著（P>0.05）。5.采用Matlab7.0软件对上述关键酶基因和MYB转录因子基因的相对表达量及总黄酮含量进行处理,分析各基因之间及其与总黄酮含量之间的相关性。结果表明,以相关系数绝对值大于0.75为阈值,子叶中总黄酮的积累与FtMyb3表达显著正相关（0.9625）,与FtMyb2表达显著负相关（-0.8572）；Chi与FtMyb2表达显著正相关（0.8468）,与FtMyb3表达显著负相关（-0.8010）；Pal、Chi和Fls表达彼此显著正相关,相关系数分别为0.9119、0.8920和0.7584。胚轴中总黄酮含量与Chi显著负相关（-0.8989）；Fls与Chi显著负相关（-0.7498）。可见,苦荞芽期黄酮合成调控较为复杂,但部分基因表达仍存在显著的相关性联系。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 植物黄酮类化合物概述
• 1.2 植物黄酮类化合物的功效
• 1.2.1 植物生理作用
• 1.2.2 黄酮类化合物的药理作用
• 1.3 类黄酮的提取、纯化方法
• 1.3.1 水提法
• 1.3.2 醇提法
• 1.4 类黄酮物质含量测定
• 1.4.1 紫外分光光度法
• 1.4.2 薄层层析-比色法
• 1.4.3 高效液相色谱法（HPLC）
• 1.5 黄酮类化合物合成关键酶基因、合成途径及其调控研究进展
• 1.5.1 黄酮类化合物代谢途径
• 1.5.2 苯丙氨酸解氨酶PAL研究进展
• 1.5.3 查尔酮异构酶CHI研究进展
• 1.5.4 黄酮醇合酶FLS研究进展
• 1.5.5 植物MYB转录因子在黄酮代谢途径中的功能研究
• 1.6 苦荞及其类黄酮
• 1.6.1 苦荞麦中生物类黄酮化学组成
• 1.6.2 苦荞生物类黄酮分布
• 1.7 研究目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 实验仪器及耗材
• 2.1.4 相关溶液配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 试验材料的准备
• 2.2.2 总黄酮的提取及测定
• 2.2.3 半定量RT-PCR模板制备
• 2.2.4 Pal、Chi、Fls、MYB转录因子基因FtMyb1、FtMyb2、FtMyb3半定量RT-PCR表达分析
• 3 结果与分析
• 3.1 总黄酮提取及其含量测定
• 3.1.1 苦荞发芽后不同天数子叶和胚轴中的含水量
• 3.1.2 芦丁标准曲线绘制及回归方程
• 3.1.3 苦荞发芽后不同天数子叶中总黄酮含量及其变化
• 3.1.4 发芽后不同天数胚轴中总黄酮含量及其变化
• 3.2 Pal、Chi和Fls基因的半定量RT-PCR分析
• 3.2.1 RNA质量检测
• 3.2.2 Pal、Chi、Fls和H3基因半定量PCR循环数的确定
• 3.2.3 Pal、Chi和Fls相对表达分析
• 3.3 FtMyb1、FtMyb2和FtMyb3的半定量RT-PCR分析
• 3.3.1 RNA提取及其质量检测
• 3.3.2 FtMyb1、FtMyb2和FtMyb3半定量PCR循环数的确定
• 3.3.3 MYB转录因子基因FtMyb1、FtMyb2、FtMyb3相对表达分析
• 3.4 子叶和胚轴中Pal、Chi、Fls与FtMyb1、FtMyb2、FtMyb3表达差异性分析
• 3.5 子叶和胚轴中总黄酮含量和关键酶基因以及MYB转录因子基因表达相关性分析
• 4 讨论与分析
• 4.1 苦荞子叶和胚轴中总黄酮含量
• 4.2 苦荞子叶和胚轴中Pal、Chi、Fls相对表达水平与总黄酮含量
• 4.2.1 Pal表达水平与总黄酮含量
• 4.2.2 Chi相对表达水平与总黄酮含量
• 4.2.3 Fls相对表达水平与总黄酮含量
• 4.3 MYB转录因子与总黄酮含量和关键酶表达的相关性
• 5 结论与创新点
• 5.1 结论
• 5.2 本研究的创新点
• 参考文献
• 致谢