芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶的纯化及其稳定性研究

论文摘要

β-甘露聚糖酶是一种重要的半纤维素酶,应用广泛,多采用微生物发酵制备。本文首先对发酵培养基进行简化与优化,并通过分离纯化制得高纯酶;进而运用圆二色、二级结构预测等方法,对酶的结构及稳定性进行研究,通过添加稳定化试剂并优化操作参数,提高了喷雾干燥产品的稳定性。主要工作如下:对发酵培养基氮源、碳源及无机盐进行筛选优化,确定了简化发酵培养基组成;最终发酵液的单位酶活成本较原始发酵培养基降低63%,大大提高了生产收益,且色素及杂质的含量也明显低于原始培养基,有利于产品的后续精制。β-甘露聚糖酶粗酶液经盐析、超滤、离子交换层析、凝胶层析及羟基磷灰石层析制得电泳纯酶蛋白。电泳分析和凝胶排阻色谱分析估算所得β-甘露聚糖酶分子量一致,约为39kDa。基于确定的氨基酸序列,运用四种算法-APSSP2、SSPRO4、PSIPRED、PHD对β-甘露聚糖酶的二级结构及部分性质进行了预测和计算,得到疏水性标度值及滴定曲线,pI=5.505,分子量38005.4。利用远紫外CD对比分析了β-甘露聚糖酶的二级结构和酶活随温度和pH的变化规律,初步探讨了二级结构变化对酶活力的影响,以优选出的CDSSTR算法计算出β-甘露聚糖酶二级结构含量为:α-螺旋42%,β-折叠13%,转角17%,无规卷曲28%,其三级结构类型为:α+β型。考察了四种添加剂（NaCl、淀粉、蔗糖、糊精）在不同浓度下对喷雾干燥制备β-甘露聚糖酶稳定性的影响,结果表明:添加蔗糖和糊精可大幅提高酶的热稳定性,加入50 mg/ml糊精,酶活提高50%,效果最佳;通过响应面法优化,确定了喷雾干燥三项主要操作参数的最优值:加料流率4.3mL/min,干燥空气流率31.3L/h,空气进口温度177℃,此时酶活较优化前提高21.9%,达3715.9U/g。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 β-甘露聚糖酶研究现状简述
• 1.1.1 β-甘露聚糖酶的来源
• 1.1.2 β-甘露聚糖酶的诱导
• 1.2 β-甘露聚糖酶的纯化
• 1.2.1 酶分离提纯的一般步骤
• 1.2.2 分离纯化工艺设计
• 1.2.3 β-甘露聚糖酶的纯化
• 1.3 β-甘露聚糖酶的结构、稳定性及稳定化
• 1.3.1 蛋白质的结构层次
• 1.3.2 蛋白质二级结构的预测
• 1.3.3 圆二色技术在蛋白质结构研究中的进展
• 1.3.4 β-甘露聚糖酶的稳定性及稳定化
• 1.4 喷雾干燥技术与响应面法
• 1.4.1 喷雾干燥技术
• 1.4.2 响应面法
• 1.5 β-甘露聚糖酶的应用
• 1.6 本文主要研究内容
• 第二章 β-甘露聚糖酶发酵培养基的优化与简化
• 2.1 实验仪器与材料
• 2.1.1 实验仪器与设备
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 菌种
• 2.1.4 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 摇瓶种子液与发酵液培养方法
• 2.2.2 β－甘露聚糖酶活力的测定
• 2.2.3 培养基优化简化方法
• 2.2.4 发酵培养基经济性评价
• 2.2.5 蛋白电泳SDS-PAGE操作方法
• 2.2.6 发酵液杂质分析
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 酶活测定标准曲线
• 2.3.2 培养基优化简化
• 2.3.3 发酵培养基经济性评价
• 2.3.4 发酵液杂质分析
• 2.4 小结
• 第三章 β－甘露聚糖酶的分离纯化
• 3.1 实验仪器与材料
• 3.1.1 试剂
• 3.1.2 实验设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 蛋白含量测定
• 3.2.2 甘露聚糖酶活力测定
• 3.2.3 硫酸铵分级沉淀
• 3.2.4 粗酶液超滤
• 3.2.5 DEAE-52 弱阴离子交换层析
• 3.2.6 Sephadex G-100 凝胶排阻层析
• 3.2.7 二次DEAE-52 离子交换层析
• 3.2.8 羟基磷灰石层析
• 3.2.9 色谱分析
• 3.2.10 蛋白质分子量测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 蛋白测定标准曲线
• 3.3.2 硫酸铵分级沉淀
• 3.3.3 超滤
• 3.3.4 DEAE阴离子交换层析
• 3.3.5 Sephadex G-100 凝胶排阻层析
• 3.3.6 二次DEAE阴离子交换层析
• 3.3.7 羟基磷灰石层析
• 3.3.8 色谱分析
• 3.3.9 蛋白质分子量测定
• 3.3.10 β-甘露聚糖酶纯化结果及纯化工艺流程图
• 3.4 小结
• 第四章 β－甘露聚糖酶结构与稳定性的研究
• 4.1 实验仪器与材料
• 4.1.1 实验仪器与设备
• 4.1.2 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 β－甘露聚糖酶二级结构预测方法
• 4.2.2 β－甘露聚糖酶特性计算方法
• 4.2.3 β－甘露聚糖酶的远紫外CD实验
• 4.2.4 β－甘露聚糖酶活力受温度及pH变化的影响
• 4.2.5 β－甘露聚糖酶三级结构类型分析
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 β－甘露聚糖酶二级结构预测
• 4.3.2 β－甘露聚糖酶特性参数计算
• 4.3.3 β－甘露聚糖酶二级结构的远紫外CD分析
• 4.3.4 温度对β－甘露聚糖酶二级结构及酶活力的影响
• 4.3.5 pH对β－甘露聚糖酶二级结构及酶活力的影响
• 4.3.6 β-甘露聚糖酶三级结构类型的分析
• 4.3.7 β-甘露聚糖酶结构对比分析
• 4.4 小结
• 第五章 响应面法优化β-甘露聚糖酶喷雾干燥条件
• 5.1 实验仪器与材料
• 5.1.1 实验仪器与设备
• 5.1.2 试剂
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 酶活测定
• 5.2.2 喷雾干燥
• 5.2.3 实验设计
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 添加剂对喷雾干燥稳定性的影响
• 5.3.2 CCD优化设计与RSM统计分析
• 5.3.3 验证实验
• 5.4 小结
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况
• 致谢