抗水霉药物的筛选及其制剂的应用效果研究

论文摘要

水霉病（Saprolegniasis）是水产养殖中一种由丝状真菌引起的常见病害,是导致育苗失败的主要因素之一,在成鱼养殖中也可能发生水霉病,若不及时采取措施可能导致该病的大规模爆发,使养殖造成巨大损失。长期以来在生产中一直以“孔雀石绿”治疗该病,并且有较好的疗效。但是孔雀石绿具有高毒性、高残留、高致癌和致畸性,2002年,中华人民共和国农业部发布的193号公告以及NY5072-2002标准《无公害食品渔用药物使用准则》中明确规定在渔业领域禁用孔雀石绿。孔雀石绿的禁用使得在控制水霉病方面缺乏安全有效的替代药物,生产上对于水霉病药物的需求十分强烈。国内外在水霉病药物的开发方面研究不足,多年来均无重大进展。本实验室经过前一阶段的研究,已经得到了一种具有高效体外抗水霉活性的物质——化合物X,为了进一步改进其性能,本研究从生物防治和化学结构改造两个方面入手,通过建立药物筛选模型,初筛、复配、安全性评价、临床药效评价等过程,研制出了一种替代“孔雀石绿”的新型药物,具有一定的创新性和推广价值,在实际的生产应用中取得了良好的应用效果。解决了水产养殖动物水霉病等真菌性疾病防治药物空白的现状,在一定程度上为解决“孔雀石绿”的滥用,保障水产品的质量安全和人类的健康发挥了重要的作用。本研究论文共分为四章。第一章:抗水霉药物体外药效评价方法的比较;第二章:抗水霉药物的筛选及其后抑菌效应;第三章:抗水霉药物的复配及其体外药效评价;第四章:抗水霉药物的安全性评价及其临床应用效果。具体内容如下:第一章:为了寻找一种稳定性高、方便快捷的体外药物筛选及体外药效评价方法,方便各药物筛选结果的比较,而且为各药物的体外药效评价提供统一、可靠的方法,利用常用的体外抗真菌药敏试验的方法,即液体稀释法与琼脂稀释法进行了三种药物对本实验室保藏的水霉菌株XJ（本实验室保藏水霉菌株）的体外抑菌效果,这三种药物包括中草药五倍子粉末、五水硫酸铜、孔雀石绿,文献报道及生产实践中均用到这三种药物来防治水霉病。通过研究两种不同的体外药效评价方法对水霉菌丝和孢子的MIC（最小抑菌浓度）值,可以得出如下结论:药物对水霉菌丝的MIC值均大于对其孢子的MIC值,在药物初筛时选择评价药物对菌丝的MIC值,由于液体稀释法与琼脂稀释法相比具有更低的MIC值,故采用液体稀释法进行初筛,以保留更多的药物进入下一步的复筛及体外药效评价。从而得到了可靠的药物筛选方法。第二章:从大量的文献资料和应用实例中广泛搜集具有潜在抗霉菌活性的物质（化合物或单质）,建立待筛选的药物库,将药物库中的药物分门别类的进行初步筛选,利用大量液体稀释法进行初筛,对水霉菌丝的最小抑菌浓度在最高浓度以上的药物进行舍弃,通过查找相关资料,进一步考虑药物的理化性质,水溶性,毒副作用及使用成本等因素,将毒性大,价格高的药物进行舍弃。将硫酸铜、硫酸铝钾、异噻唑啉酮、磺基水杨酸、尼泊金乙酯、MBT（二硫氰基甲烷）作为复筛药物进行体外药效评价。通过两种方法的体外药效评价,得到了上述药物对水霉菌丝及孢子的体外作用效果。同时研究了两种优良防霉剂的后抗真菌效应。第三章:为了考察上述几种化合物与化合物X的联合使用效果,分别评价了异噻唑啉酮、磺基水杨酸、尼泊金乙酯、MBT与化合物X配合使用后对水霉菌的联合抑菌作用,选择其中与化合物X具有协同作用的化合物进行了不同比例的配比,确定了两者之间的最佳配比为5:2,以该比例将两种药物混合后配以辅料气相二氧化硅,制成了一种新的抗水霉药物,即化合物X制剂。测定了化合物X制剂对水霉菌的体外作用效果,其对水霉孢子的MIC值为1ppm,其对水霉菌丝的MIC为5ppm,为了使生产中的用药成本最低,建议化合物X制剂的推荐浸泡用量为5mg/L。第四章:为了验证化合物X制剂在实际生产中的应用效果,进行了化合物X制剂的安全性评价及临床应用效果研究,化合物X制剂对大宗淡水养殖鱼类的安全浓度在5mg/L以上,对鱼卵在50mg/L以内是安全的,对虾蟹类卵在25mg/L以内是安全的。临床应用研究表明,其在5ppm以上时可以显著降低水霉病的发病率（p<0.05）,在50ppm以内未显著降低异育银鲫和加州鲈的出苗率（p>0.05）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1. 研究背景
• 1.1 水霉病的病原
• 1.2 水霉菌的分离、培养和鉴定
• 1.3 水霉病的症状及病因
• 1.4 水霉病的药物防治及抗水霉药物开发现状
• 2. 抗水霉菌药物的体外药效评价方法
• 2.1 固基法
• 2.2 液基法
• 3. 立题意义
• 4. 主要研究内容
• 第一章：抗水霉药物体外药效评价方法的比较
• 1.1 引言
• 1.2 材料与方法
• 1.2.1 试验药物及培养基
• 1.2.2 菌株来源
• 1.2.3 药物对菌丝的作用
• 1.2.4 药物对孢子的作用
• 1.2.5 方法可靠性检验
• 1.2.6 数据处理
• 1.3 结果
• 1.3.1 药物对菌丝的作用
• 1.3.2 药物对孢子的作用
• 1.3.3 方法的比较及可靠性检验
• 1.4 小结
• 1.5 讨论
• 第二章 抗水霉药物的筛选及其后抑菌效应
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株来源
• 2.2.2 试验用培养基
• 2.2.3 待筛选药物库的建立
• 2.2.4 初筛中草药提取液的制备
• 2.2.5 初筛化学药物工作浓度的配制
• 2.2.6 水霉菌株的培养
• 2.2.7 水霉孢子悬液的制备
• 2.2.8 大量药物的初筛方法
• 2.2.9 复筛药物工作浓度的配制
• 2.2.10 复筛药物的体外药效评价
• 2.2.11 两种优良防霉剂对水霉菌的后抗真菌效应
• 2.3 结果
• 2.3.1 大量药物的初筛结果
• 2.3.2 复筛药物的体外药效评价
• 2.3.3 两种优良防霉剂对水霉菌的后抗真菌效应
• 2.4 小结
• 2.5 讨论
• 第三章 抗水霉药物的复配及其体外药效评价
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试验药物及培养基
• 3.2.2 菌株来源
• 3.2.3 四种药物分别与化合物X 联合后对水霉菌的联合抑菌效应
• 3.2.4 磺基水杨酸与化合物X 的最佳组合比例的确定
• 3.2.5 化合物X 制剂对水霉的体外作用效果
• 3.3 结果
• 3.3.1 异噻唑啉酮与化合物X 对水霉菌的联合抑菌效应
• 3.3.2 二硫氰基甲烷与化合物 X 对水霉菌的联合抑菌效应
• 3.3.3 尼泊金乙酯与化合物 X 对水霉菌的联合抑菌效应
• 3.3.4 磺基水杨酸与化合物 X 对水霉菌的联合抑菌效应
• 3.3.5 磺基水杨酸与化合物 X 的最佳组合比例的确定
• 3.3.6 化合物 X 制剂对水霉的体外作用效果
• 3.4 小结
• 第四章 抗水霉药物的安全性评价及其临床应用效果
• 4.1 引言
• 4.2 化合物 X 制剂对异育银鲫的急性毒性试验
• 4.2.1 材料与方法
• 4.2.2 结果
• 4.3 化合物X 制剂对尼罗罗非鱼的急性毒性试验
• 4.3.1 材料与方法
• 4.3.2 结果
• 4.4 化合物 X 制剂对异育银鲫鱼卵孵化率的影响
• 4.4.1 材料与方法
• 4.4.2 结果
• 4.5 化合物 X 制剂对加州鲈卵孵化率的影响
• 4.5.1 材料与方法
• 4.5.2 结果
• 4.6 化合物X 制剂对小龙虾离体卵孵化率的影响
• 4.6.1 材料与方法
• 4.6.2 结果
• 4.7 化合物 X 制剂在鱼卵孵化过程中的临床应用效果研究
• 4.7.1 试验地点和时间
• 4.7.2 试验材料
• 4.7.3 试验方法
• 4.7.4 试验结果
• 4.8 小结
• 4.9 讨论
• 参考文献
• 附录 A:在读硕士期间发表的相关论文
• 致谢