水稻籽粒叶酸含量QTL分析及生物强化

论文摘要

叶酸（维生素B9族）含量是稻米重要营养品质性状之一。本文从控制叶酸含量的数量性状位点分析和外源基因表达开展稻米叶酸强化研究。针对水稻种质资源进行高叶酸种质筛选,并考察了储藏时间和蒸煮对稻米叶酸含量的影响;通过利用Lemont/特青RIL群体和Koshihikari×Kasalath BIL群体进行了稻米叶酸含量QTL分析;利用拟南芥来源的7个叶酸合成途径相关基因进行水稻叶酸生物合成代谢改造,同时对水稻内源叶酸生物合成途径基因的表达与调控进行分析,主要研究结果如下:1.利用优化的三酶法和微生物法对78份水稻种质资源进行叶酸含量测定。不同品种的糙米和精米叶酸含量变化范围分别为13.3111.4μg/100g和10.377.7μg/100g。朝阳早18,特青,大白谷13及青丰矮为高叶酸含量品种,其糙米叶酸含量均大于100μg/100g。储藏和蒸煮过程使稻米叶酸含量分别损失了23%和48.3%。地方品种老鼠牙在蒸煮后叶酸含量最高（26.3μg/100g）,如果以每日人均食用400 g的米饭进行计算,它可以为人们提供每日推荐食用量的25%叶酸（国际推荐成人服用叶酸用量为400μg/100g）。因此,今后可望通过进一步筛选高叶酸种质用于水稻营养品质常规育种。2.利用Lemont/特青重组自交系群体在20092010年2个环境中检测到2个叶酸含量相关QTL（qFC-3a和qFC-3b）,其中qFC-3b位点在两年中稳定表达,贡献率平均为13.4%。利用Koshihikari/Kasalath//Koshihikari回交重组自交系群体在2010年检测到1个叶酸含量相关QTL qFC-3c,其贡献率为24.8%,该群体中不同位点间存在上位性互作。3.在T2代转基因阳性植株中,系统分析了拟南芥来源的7个叶酸合成途径相关基因对水稻叶酸生物强化的作用,主要包括以下三种类型:（1）过表达AtGCHI,AtDHFS和AtFPGS基因能够提高种子叶酸含量,相对于野生型分别提高了265.8%505.4 %,8.0%17.0 %和1.2%21.2 %,然而其叶片平均叶酸含量分别降低32.3%,20.2%和0.8%;（2）过表达AtDHNA和AtADCL基因使种子平均叶酸含量比野生型分别降低10.5%和12.9%,AtADCL转基因株系的叶片平均叶酸含量相对野生型降低21.8%;（3）AtHPPK和AtDHFR转基因株系的种子平均叶酸含量均与野生型无显著差异,但是AtHPPK基因的一个转基因株系A263-10,其种子平均叶酸含量相对野生型提高9.4%,过表达AtHPPK和AtDHFR基因使叶片平均叶酸含量分别比野生型降低了25.5%和27.0%。可见,异源表达拟南芥基因AtGCHI,AtDHFS和AtFPGS对种子叶酸含量的提高具有正向效果,过表达其它基因不利于种子叶酸含量的积累或起负向作用。4.水稻幼根、幼茎、幼叶,成熟根、茎、叶、25DPA的胚与胚乳均具有从头合成叶酸的能力。这些组织中的内源叶酸含量从高至低依次为幼叶>成熟叶片>胚>幼根>幼茎>成熟根>成熟茎>25天胚乳。水稻种子发育1030DPA过程中总叶酸含量依次降低。而种子叶酸合成途径基因的表达与其叶酸含量变化趋势不同。单拷贝基因OsGCHI,OsDHFS和种子优势表达基因之一OsDHNAⅢ在种子发育1030DPA过程中表达逐渐升高而后下降。其它种子优势表达基因OsADCL I和OsFPGS I与单拷贝基因OsADCS和OsHPPK的表达趋势一致,即随着种子的发育表达量逐渐增加,并在种子发育30DPA时达到最高。OsDHFR I基因在种子发育不同时期（1030 DPA）呈现组成型表达的特点,OsDHFRⅡ随着种子发育表达量迅速下降。OsDHNA I,OsDHNAⅡ和OsFPGSⅡ基因在种子发育过程中无显著变化。因此单拷贝基因OsGCHI,OsDHFS,OsADCS和OsHPPK,种子优势表达基因OsDHNAⅢ,OsADCL I和OsFPGS I及持续高表达的OsDHFR I基因可能在种子叶酸从头合成过程中具有重要作用。5.水稻叶酸合成途径内源基因受叶酸变化水平的调控。转化AtGCHI基因（拟南芥来源的GTP环化脱羧酶基因）的水稻转基因株系中,种子叶酸含量比野生型提高了3.76.1倍,其内源基因OsDHNAⅡ,ADCS和FPGS I,Ⅱ的表达量较野生型显著降低。叶片叶酸含量比野生型平均降低32.3%,而其内源基因OsGCHI,OsADCS,OsADCL c,OsHPPK,OsFPGS I和OsFPGSⅡ均有显著提高。因此,水稻叶酸合成途径的调控可能存在反馈调节机制,受叶酸含量影响而产生表达量变化的基因可能是潜在的调节点。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 叶酸的化学结构与生理作用
• 1.2 叶酸缺乏与人类疾病
• 1.2.1 神经管缺陷（NTDs）
• 1.2.2 心血管疾病（Cardiovascular Disease）
• 1.2.3 癌症（Cancer）
• 1.2.4 其他疾病
• 1.3 植物天然叶酸及其分布
• 1.3.1 植物叶酸含量
• 1.3.2 叶酸的亚细胞分布
• 1.3.3 叶酸含量随植物发育过程的变化
• 1.3.4 多聚谷氨酰叶酸分布
• 1.4 作物叶酸含量的检测
• 1.4.1 作物叶酸含量的提取
• 1.4.2 叶酸含量的测定
• 1.5 植物叶酸的生物合成和转运
• 1.5.1 植物叶酸生物合成途径基因
• 1.5.2 植物叶酸转运蛋白相关基因的克隆
• 1.6 人类健康相关的植物代谢基因工程
• 1.7 叶酸强化研究进展
• 1.7.1 化学合成叶酸的添加及副作用
• 1.7.2 叶酸生物强化和可行性
• 1.8 本研究的目的和意义
• 第二章 水稻种质资源叶酸含量分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试剂及仪器
• 2.1.3 种子叶酸含量分析
• 2.1.4 统计分析方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 三酶法的酶量优化
• 2.2.2 78 份水稻种质的糙米和精米总叶酸含量
• 2.2.3 叶酸在储藏和蒸煮过程中的损失
• 2.3 讨论
• 2.3.1 三酶法的优化及稻米叶酸含量的比较
• 2.3.2 储藏时间及蒸煮等因素导致叶酸的损失
• 2.3.3 高叶酸水稻种质可望作为常规育种基础材料
• 第三章 稻米叶酸含量的QTL 定位及稳定性分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 田间试验
• 3.1.3 种子叶酸含量分析
• 3.1.4 数据分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 Lemont/特青 RILs 群体的叶酸含量相关QTL 定位
• 3.2.2 Koshihikari×Kasalath BILs 群体的叶酸含量QTL 定位
• 3.3 讨论
• 3.3.1 第3 染色体上存在叶酸含量相关QTLs
• 3.3.2 不同群体QTL 定位结果比较
• 3.3.3 叶酸相关基因的查询及预测
• 第四章 水稻叶酸生物强化研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试剂、菌株和质粒
• 4.1.3 基因克隆
• 4.1.4 载体构建
• 4.1.5 基因的遗传转化及转基因植株种植
• 4.1.6 转基因植株的PCR 检测
• 4.1.7 Real time PCR 分析
• 4.1.8 叶酸含量分析
• 4.1.9 制备大肠杆菌和农杆菌感受态
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 拟南芥和水稻叶酸合成途径基因的同源性分析
• 4.2.2 拟南芥叶酸合成途径基因的克隆、载体构建及遗传转化
• 4.2.3 外源基因在水稻转基因植株叶片和种子中的表达分析及叶酸含量测定
• 4.2.4 转基因株系的农艺性状调查
• 4.2.5 双过表达转基因株系的产生
• 4.3 讨论
• 4.3.1 AtGCHI，AtDHFS，AtFPGS 基因的异源表达提高了水稻种子叶酸含量
• 4.3.2 水稻叶酸生物强化的其它代谢工程策略
• 第五章 水稻内源叶酸合成途径基因的表达及调控
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 样品采集
• 5.1.2 RNA 提取及Realtime PCR 分析
• 5.1.3 叶酸含量分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 水稻叶酸合成途径基因及叶酸含量的组织表达模式
• 5.2.2 水稻叶酸合成途径基因及叶酸含量在种子发育过程的表达模式分析
• 5.2.3 AtGCHI 转基因株系中的叶酸合成基因表达变化
• 5.3 讨论
• 5.3.1 叶酸合成途径表达模式分析
• 5.3.2 水稻叶酸合成途径调控属于反馈调节机制
• 第六章 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历