水稻OsLecRK1基因功能研究初探

水稻OsLecRK1基因功能研究初探

论文摘要

OsLecRK1基因是对水稻细菌性条斑病侵染应答的差异蛋白质组学研究中发现的一个水稻中编码RLK蛋白的基因。该基因的cDNA全长为2361 bp,其中2046 bp的开放阅读框编码681个氨基酸。OsLecRK类似于植物类受体蛋白激酶(receptor-like kinase,RLK),此类蛋白通常由胞外信号序列、跨膜结构域和激酶结构域组成。在植物体对外界胁迫、激素、病原物的应答过程中,RLK起着关键作用。植物凝集素类受体蛋白激酶(lectin-like receptor kinases,LecRKs)是在拟南芥中首次发现并得以命名。LecRK与RLK有着类似的结构,都包括N端靶序列、胞外结构域、跨膜结构和激酶结构域几个部分。植物凝集素是一类具有高度特异性糖结合活性的蛋白,含有一个或多个可与单糖或寡聚糖特异可逆结合的非催化结构域。它的糖结合特异性主要针对外源寡糖,主要生理功能是介导植物的防御反应。这说明LecRK有可能在植物发育、机械损伤和抵抗逆境等反应中发挥作用。但是,目前还不明确这类蛋白到底在生物体相关应答途径中行使何种生物学功能。水稻细菌性条斑病是由Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola侵染引起的细菌性病害,简称细条病,现已成为威胁我国南方稻区水稻生产的重要病害,也是我国重要的检疫性水稻病害。由水稻细菌性条斑病所引起的产量损失通常为15~25%,严重时可达40~60%。因此,分离和克隆细条病相关抗性基因并进一步明确这些基因的抗病机制,对于控制细条病的发生与发展,减少经济损失具有重要的理论和现实意义。本课题是基于水稻蛋白质组学的研究,通过双向电泳联用质谱技术得到差异表达蛋白点,并根据蛋白序列分析结果,设计PCR引物,经RT-PCR,从水稻cDNA中,获得若干水稻激酶-RLK类基因片断,OsLecRK1正是其中之一。信息学分析表明该基因定位在水稻第七号染色体上,GenBank编号为XM476511。Northern杂交证明接种水稻细菌性条斑病可以诱导OsLecRK1的表达。然后我们分别针对稻OsLecRK1基因构建了植物超量表达载体p1301-35S-OsLecRK1-Tnos和RNAi载体pDS1301-OsLecRK1,目的是分别增强和减弱OsLecRK1的表达量,对比给植物体带来生物学功能上的差异。我们以水稻作为受体植物进行基因转化,最后对转化体进行了鉴定并得到了初步结果。为水稻OsLecRK1基因功能的进一步研究奠定了基础。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 1 文献综述
  • 1.1 水稻细菌性条斑病研究进展
  • 1.1.1 水稻细菌性条斑病概况
  • 1.1.2 水稻抗细菌性条斑病研究进展
  • 1.2 水稻抗性基因工程研究进展
  • 1.2.1 Bt 抗虫转基因水稻
  • 1.2.2 转Xa21 基因抗白叶枯病水稻
  • 1.2.3 稻瘟病分子生物学研究进展
  • 1.3 植物凝集素类受体蛋白激酶(LECRK)研究进展
  • 1.4 本课题研究的内容和意义
  • 2 材料与方法
  • 2.1 实验材料
  • 2.1.1 目的基因
  • 2.1.2 病原菌
  • 2.1.3 农杆菌菌种
  • 2.1.4 受体植物材料
  • 2.1.5 主要化学试剂及仪器
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 水稻OsLecRK1 基因的生物信息学分析
  • 2.2.2 RT-PCR 检测OsLecRK1 保守区片段
  • 2.2.3 OsLecRK1 的Northern 杂交分析
  • 2.2.4 植物过量表达载体的构建
  • 2.2.5 RNAi 载体的构建
  • 2.2.6 水稻中花11 的组织培养
  • 2.2.7 农杆菌介导的水稻中花11 遗传转化
  • 2.2.8 水稻转化体的筛选鉴定
  • 3 结果与分析
  • 3.1 水稻OSLECRK1 基因的生物信息学分析
  • 3.1.1 确定了水稻中最少还有188 个LecRK 类基因
  • 3.1.2 水稻LecRK 类基因在染色体上的分布情况
  • 3.1.3 水稻LecRK 类基因的多序列联配和同源性分析
  • 3.2 OSLECRK1 基因的RT-PCR 检测和NORTHERN 验证
  • 3.3 植物过量表达载体的构建及鉴定
  • 3.3.1 克隆载体的构建及重组子的鉴定
  • 3.3.2 中间载体pBPF-OsLecRK1 的构建及重组子的鉴定
  • 3.3.3 表达载体p1301-355-OsLecRK1-Tnos 的构建及重组子的鉴定
  • 3.4 RNAI 载体的构建及重组子的鉴定
  • 3.5 转基因水稻组织培养
  • 3.6 GUS 基因表达检测
  • 3.6.1 转化后愈伤组织GUS 基因表达检测
  • 3.6.2 再生植株叶片GUS 基因表达检测
  • 3.7 再生植株PCR 检测
  • 3.8 再生植株OSLECRK1 转录水平的半定量RT-PCR 检测
  • 4 讨论
  • 4.1 OSLECRK1 基因的结构特征
  • 4.2 OSLECRK1 基因的定位
  • 4.3 植物凝集素与植物防御反应
  • 4.4 RNAI 技术及其在转基因水稻中的应用
  • 4.5 水稻的成熟胚组织培养
  • 5. 结论与展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录1: 培养基及试剂的配制
  • 附录2: 重组载体P1301-35S-OSLECRK1-TNOS 测序及比对结果
  • 附录3: RNAI 载体PDS1301-OSLECRK1 测序及比对结果
  • 相关论文文献

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