论文题目: 重组GDNF质粒转染许旺氏细胞及构建生物活性人工神经室的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 耳鼻咽喉科学
作者: 田宏斌
导师: 周梁,戴春富,王纾宜
关键词: 许旺氏细胞,牛脑垂体浸出液,组职工程,脊髓后根神经节,细胞培养,胶质细胞源性神经生长因子,质粒,增强型绿色荧光,克隆,逆转录多聚酶链式反应,总核糖核酸分离试剂,转染,荧光免疫分析,激光共聚焦显微镜,聚乳酸,聚羟基乙酸,神经组织工程,人工神经室,周围神经系统
文献来源: 复旦大学
发表年度: 2005
论文摘要: 迄今,周围性面神经断伤后的修复仍然是耳鼻咽喉头颈外科、口腔颌面外科、整形外科的挑战性难题。即使最及时、最精确的显微吻合手术也不可能达到面部运动功能的完全恢复;而被称为“金标准”的面神经损伤后神经移植修复术,其功能恢复也很少优于House Brackmann面神经功能评分Ⅲ级。应用神经组织工程学的方法来促进面神经的再生和修复已成为当今研究的新热点。人工神经室是以具有良好生物相容性的可降解高分子聚合物为载体,与种子细胞(许旺氏细胞等)结合而成的具有特定三维结构和生物活性的复合体。GDNF是迄今为止对运动神经元保护作用最强的神经因子,但缺乏给药的有效途径,利用基因工程将GDNF重组质粒转染许旺氏细胞有望解决这一难题。因此,对许旺氏细胞体外培养、构建GDNF重组质粒转染许旺氏细胞以及将许旺氏细胞种植于聚羟基乙酸神经室进行了研究,全文分为四个部分: 第一部分 大鼠组织工程化许旺氏细胞体外培养的研究 目的:获得最佳的许旺氏细胞培养方法,以应用于神经组织工程学。 方法:对脊髓后根神经节取材、乳鼠臂从及坐骨神经取材、改变阿糖胞苷抑制成纤维细胞作用时间;加入神经生长因子及牛脑垂体浸出液等不同条件下,获得许旺氏的时间,数量,纯度进行比较。 结果:通过剥除乳鼠臂从神经、坐骨神经外膜;16-24小时应用阿糖胞苷;在培养液中加入20%胎牛血清及50mg/L牛脑垂体浸出液;细胞传代应用低浓度酶快速消化及差速贴壁等方法,最短原代细胞融合时间缩短为6天,细胞量大于2×10~7/ml,细胞纯度超过95%。 结论:剥除乳鼠臂从神经、坐骨神经外膜;早期、短时应用阿糖胞苷;培养液中加入20%胎牛血清及50mg/L牛脑垂体浸出液;细胞传代应用低浓度酶快速消化及差速贴壁法是获得神经组织工程用途的最佳方法。
论文目录:
缩略词表
中文摘要
英文摘要
引言
技术路线
第一部分 大鼠组织工程化许旺氏细胞体外培养的研究
前言
实验一 由SD大鼠脊髓后根神经节取材的许旺氏细胞培养
材料和方法
结果
实验二 由初生SD大鼠坐骨神经及臂从神经取材体外培养雪旺氏细胞的研究
材料和方法
结果
实验三 应用于神经组织工程的许旺氏细胞不同培养方法的研究
材料和方法
结果
讨论
结论
第二部分 构建重组质粒pcDNA3.1(+)／GDNF及pEGFP—N1／GDNF的研究
前言
实验一 RNA提取与扩增
材料和方法
结果
实验二 pcDNA3.1(+)／GDNF的克隆与表达载体的构建
材料和方法
结果
实验三 pEGFP—N1／GDNF的克隆与表达载体的构建
材料和方法
结果
讨论
结论
第三部分 pEGFP—N1／GDNF、pcDNA3.1(+)／GDNF经Lipofectamine2000转染许旺氏细胞的研究
前言
实验一 G418最低药物浓度筛选
材料和方法
结果
实验二 pEGFP—N_1／GDNF经Lipofectamine2000转染许旺氏细胞
材料和方法
结果
实验三 pcDNA3.1(+)／GDNF经Lipofectamine2000转染许旺氏细胞
材料和方法
结果
讨论
结论
第四部分 体外培养纯化许旺氏细胞种植于PLGA人工神经室的研究
前言
材料和方法
结果
讨论
结论
全文总结
参考文献
文献综述
附录
致谢
发布时间: 2005-09-19
参考文献
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