山羊胚胎干细胞和胚胎生殖细胞的分离培养与鉴定

论文摘要

山羊胚胎干细胞（ESCs）和胚胎生殖细胞（EGCs）是制备乳腺生物反应器理想的候选细胞,然而至今仍没有成功建系的报道。本研究选用体内来源的关中奶山羊胚胎和胎儿为试验对象,参照小鼠和人ESCs和EGCs报道的建系方法,系统比较了不同培养条件和传代方法对分离培养不同发育时期山羊胚胎ESCs和胎儿EGCs的影响,主要获得以下结论:1.超排处理45只山羊（42只关中奶山羊,3只波尔山羊）,共得到可用胚胎341枚,其中4～16细胞胚胎26枚,桑椹胚144枚,囊胚108枚,孵化胚63枚。在以“桑椹胚全胚、去带桑椹胚、囊胚全胚、ICM和胚盘阶段的胚胎”为起始材料分离山羊类ESCs的试验中,发现“去带桑椹胚、ICM和胚盘阶段的胚胎”分离效果较佳。“桑椹胚全胚和囊胚全胚”在接种饲养层后,贴壁率较低（如囊胚全胚贴壁率为38.1%,内细胞团贴壁率为76.5%,二者差异显著,P﹤0.05）,不适宜直接作为分离ESCs的起始材料。2.将ICM培养于小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）饲养层上,以DMEM为基础培养液,研究了含血清和无血清条件下ICM的增殖规律。结果表明,无血清培养可以减少ICM分化的发生。而且在无血清培养条件下比较了添加不同生长因子对ICM（共计48个）增殖的影响,结果表明添加MEF条件培养液,STO条件培养液、大鼠心肌（rHF）条件培养液、LIF、bFGF、两种生长因子同时添加或都不添加对原代ESCs样集落出现率的影响不显著（P > 0. 05）,但添加10 ng/mL bFGF稍微有助于ICM增殖。这些结果表明山羊ICM适宜于无血清培养。在山羊类ESCs传代方面,比较了机械法、酶消化法和二者结合的方法对传代效果的影响,酶消化法最高传至2代,机械法最高传至9代,机械法加酶消化的方法最高传至5代。3.山羊类ESCs集落形态多样,类ESCs集落AKP染色阳性,Oct-4和SSEA-1免疫组化染色阳性,SSEA-4阴性。在体外可以自发分化为神经样或上皮样细胞。4.自然配种8只奶山羊,获得交配后28～42d胎儿9只,另外由屠宰场收集山羊胎儿32只。在41只山羊胎儿中,仅对臀冠长为20～25 mm的胎儿（胎龄约为35d）进行比较。最终符合条件的15只胎儿共获得219个原代类EGCs集落。采用生殖嵴与同源胎儿成纤维细胞共培养的方法获得的原代集落数较多,与传统的人与小鼠分离PGCs的分离方法相比差异不显著（P>0.05）。在山羊类EGCs传代方面,比较了机械法、酶消化法或二者结合的方法进行山羊类EGCs传代的效果,酶消化法最高传至4代,机械法和“机械法辅助酶消化法”可传至9～12代,表明机械法可以获得较高的传代数。但是在试验中发现,单纯的机械法切割易于损伤新集落边缘的细胞,从而影响了集落的形态,

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 综述部分
• 第一章 哺乳动物胚胎干细胞研究进展
• 1.1 胚胎干细胞研究历史
• 1.2 胚胎干细胞建系的方法
• 1.3 以胚胎干细胞为基础的基因功能研究
• 1.3.1 各种技术简介
• 1.3.2 各种技术优缺点比较
• 1.4 胚胎干细胞的分子生物学研究
• 1.4.1 胚胎干细胞中高表达的基因
• 1.4.2 胚胎干细胞多能性维持和自我更新的分子机制
• 第二章 胚胎干细胞本质与起源的探讨
• 2.1 胚胎干细胞概念及发展
• 2.2 胚胎多能性细胞和早期生殖细胞发育的研究现状
• 2.3 早期胚胎细胞（ICM 和上胚层）、生殖细胞与胚胎干细胞的关系
• 2.3.1 胚胎多能性细胞、早期生殖细胞与胚胎干细胞特性的比较
• 2.3.2 胚胎多能性细胞和早期生殖细胞向胚胎干细胞的转化
• 2.4 胚胎干细胞与其他类型干细胞间关系的假说
• 2.5 存在的问题与思考
• 2.6 结论
• 第三章 家畜胚胎干细胞建系的研究进展
• 3.1 牛胚胎干细胞的研究概况
• 3.1.1 牛ESCs 的研究进展
• 3.1.2 牛EGCs 的研究进展
• 3.2 猪胚胎干细胞的研究概况
• 3.2.1 猪ESCs 的研究进展
• 3.2.2 猪EGCs 的研究进展
• 3.3 山羊和绵羊胚胎干细胞的研究概况
• 3.3.1 山羊和绵羊ESCs 的研究进展
• 3.3.2 山羊和绵羊EGCs 的研究进展
• 3.4 家畜胚胎干细胞研究进展缓慢的原因探讨
• 实验部分
• 第四章 山羊早期胚胎材料的获取
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 超排处理后山羊的采胚状况
• 4.2.2 自然配种山羊的采胚状况
• 4.2.3 取自屠宰场胎儿的状况
• 4.2.4 超排处理山羊采胚状况与黄体形态关系的统计
• 4.2.5 正常黄体与早期退化黄体的组织学特征
• 4.3 讨论
• 4.3.1 山羊早期胚胎和原始生殖细胞发育的特点
• 4.3.2 超排处理对山羊发生早期黄体退化的影响
• 4.3.3 山羊胚胎工程及相关技术的发展
• 4.4 小结
• 第五章 源于山羊囊胚和孵化胚阶段ESCS 的分离、培养与鉴定
• 5.1 材料
• 5.1.1 山羊胚胎、小鼠、大鼠和家兔
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 胚胎和ESCs 集落分割工具
• 5.2 方法
• 5.2.1 兔抗山羊血清的制备与检测
• 5.2.2 山羊囊胚ICM 的分离
• 5.2.3 MEF、GEF、大鼠胎肝成纤维细胞和fbLF 细胞饲养层的制备
• 5.2.4 MEF、STO 和大鼠心肌条件培养液的制备
• 5.2.5 山羊囊胚全胚、ICM、裸胚和胚盘细胞的体外培养
• 5.2.6 山羊ICM 和类ESCs 集落的鉴定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 兔抗山羊血清效价的测定
• 5.3.2 不同方法分离ICM 的效果
• 5.3.3 山羊囊胚全胚、ICM、裸胚和胚盘细胞的体外培养结果
• 5.3.4 山羊ICM 与类ESCs 集落的鉴定
• 5.4 讨论
• 5.4.1 抗血清 50%溶红细胞率可以为免疫外科法分离山羊 ICM 提供参考
• 5.4.2 山羊ICM 和胚盘细胞均为混合细胞群体
• 5.4.3 影响山羊类ESCs 建系的主要因素
• 5.5 小结
• 第六章 山羊原始生殖细胞的分离、培养与鉴定
• 6.1 材料
• 6.1.1 山羊胎儿
• 6.1.2 主要试剂和干细胞集落分割工具
• 6.2 方法
• 6.2.1 山羊胎儿的处理
• 6.2.2 MEF 和GEF 饲养层的制作
• 6.2.3 山羊PGCs 的分离和培养
• 6.2.4 山羊EGCs 的传代和培养
• 6.2.5 山羊PGCs 和EGCs 的鉴定
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 山羊PGCs 的分离和培养
• 6.3.2 山羊EGCs 的传代和培养
• 6.3.3 山羊PGCs 和EGCs 的鉴定
• 6.4 讨论
• 6.4.1 分离山羊PGCs 适宜的胎龄
• 6.4.2 山羊PGCs 的分离与纯化
• 6.4.3 山羊PGCs 和EGCs 的培养
• 6.5 小结
• 第七章 源于山羊桑椹胚阶段ESCS 的分离、培养与鉴定
• 7.1 材料
• 7.1.1 山羊胚胎
• 7.1.2 主要试剂和ESCs 传代工具
• 7.2 方法
• 7.2.1 桑椹胚和早期卵裂期阶段的胚胎卵裂球的分离
• 7.2.2 山羊桑椹胚卵裂球的体外培养
• 7.2.3 山羊类ESCs 集落的鉴定
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 不同处理方式和接种方法对山羊桑椹胚卵裂球体外培养的影响
• 7.3.2 山羊桑椹胚全胚和卵裂球的体外培养
• 7.4 讨论
• 7.5 小结
• 结论
• 本论文创新之处
• 进一步研究的课题
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介