论文摘要
两栖类动物属于一类可持续利用的自然资源,它们具有药用、食用、美学等多种科研及利用价值。此外,它们的组织中含有大量分子结构特殊、功能复杂多样的生物活性物质,是有待于开发的资源宝库。中国拥有丰富的两栖类动物资源,共有325个种（亚种）,其中2/3是特有种类,它是我国生物资源的重要组成部分,也是人类的宝贵财富,因此我国两栖类动物资源的开发利用有很大的潜力。目前,已从两栖类动物中分离鉴定出许多具有多种生物活性的蛋白及多肽。通过生物化学,分子生物学的手段和研究方法,从两栖动物黑带蛙（Rananigrovittata）皮肤分泌液中,我们得到了两种皮肤生物活性多肽类物质,包括一个胆囊收缩素和一个缓激肽,并分别对这两种活性多肽类物质进行了研究。通过Sephadex G-50凝胶过滤、反相高压液相色谱等手段,从黑带蛙皮肤分泌液中分离到一个胆囊收缩素（cholecystokinin,CCK）。Edman降解测序结果显示:CCK的N-末端氨基酸残基序列为RVDGNSDQKAVIGAMLAKDLQTRKAX。BLAST分析结果表明,该氨基酸残基序列与从牛蛙（Rana catesbeiana）和非洲爪蟾（Xenopus laevis）中得到的胆囊收缩素具有显著的同源性。根据胆囊收缩素（CCK）的保守性,我们以编码牛蛙胆囊收缩素（CCK）信号肽起始密码子开始的21个碱基设计5’特异性引物,从黑带蛙皮肤cDNA文库中克隆到了编码CCK的cDNA全序列。我们首次从两栖动物皮肤中发现了胆囊收缩素,并也在皮肤中克隆得到了它的cDNA序列。通过基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱得知从黑带蛙皮肤分离的到胆囊收缩素（CCK）的分子量为6584.07 Da,该分子量与由CCK的cDNA序列推导得到的分子量6502.26 Da多80 Da。已知从牛蛙的大脑、腹腔中分离到的CCKs在氨基酸序列中有一个酪氨酸残基硫酸化（Tyr-SO3）位点。当酪氨酸残基硫酸化之后,将导致约80 Da分子量的增加,因此这极有可能是黑带蛙CCKs在氨基酸残基序列中Tyr处也发生了硫酸化（Tyr-SO3）的结果。通过分子筛、反相高压液相色谱等分离纯化方法,从黑带蛙皮肤分泌物中分离得到了一种缓激肽,命名为Ranakinin-N,具有促离体豚鼠回肠肌收缩的活性,并且它对离体豚鼠回肠肌收缩的活性的影响具有浓度依赖性。Edman降解和快原子轰击质谱法分析结果:氨基酸序列为RAEAVPPGFTPFR,理论分子量为1442.8 Da。Ranakinin-N与从其它两栖动物分离得到的缓激肽在结构上具有很高的相似性。像其它的缓激肽类似肽一样,Ranakinin-N也具有PPGF四氨基酸残基的保守区域。将Ranakinin-N的cDNA序列与另一种两栖动物花臭蛙（Odorrana schmackeri）中编码缓激肽cDNA的序列进行BLAST分析,发现Ranakinin-N的cDNA成熟肽编码区少了15个核苷酸（agaatgatcagacgc）,而这15个碱基存在于花臭蛙Odorranaschmackeri编码缓激肽的cDNA序列中,这种缺失导致了一个类胰蛋白酶位点的缺乏,并且在Ranakinin-N的N-末端有四个氨基酸AEAV的插入,AEAV的插入导致Ranakinin-N的N-末端呈中性净电荷的状态。Ranakinin-N是首次报道在N-末端呈中性净电荷状态存在的缓激肽。