论文摘要
近年,随着三维适形放疗技术（three dimensional conformal radiotherapy,3DCRT）的发展,中晚期肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）的放射治疗正日益引起人们的关注。然而,HCC常合并有肝硬变并具有高增殖性的特点,造成肿瘤内部乏氧细胞的存在,这些乏氧肿瘤细胞的辐射敏感性明显降低,成为肿瘤治疗失败和复发的重要原因之一。乏氧肿瘤细胞可通过自身内源基因的表达变化来适应乏氧微环境,其中乏氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）是调节肿瘤细胞对乏氧反应的重要转录因子,由α和β两个亚基组成,其中HIF-1α是HIF-1的活性调节单位,与肿瘤的复发、高侵袭性、放化疗的抵抗性以及预后不良等特点密切相关。同时,在肿瘤治疗过程中,某些药物和治疗手段也能够刺激乏氧肿瘤细胞中HIF-1α表达水平的升高,造成肿瘤疗效的降低。由于HIF-1α的表达可受到细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平的调节,在放疗过程中,γ射线能够影响乏氧细胞内谷胱甘肽的含量,引起细胞中ROS水平的变化,从而有可能使HIF-1α的表达发生变化。因此,深入研究照射后乏氧肿瘤细胞内HIF-1α的表达变化。同时,观察放射抗拒细胞中是否存在高表达的HIF-1α及其抗性作用的相关发生机制,对于发展新的肿瘤放射治疗技术以及寻找新型肿瘤放射增敏剂的作用靶点具有重要意义。目的1谷胱甘肽变化影响乏氧肝癌细胞中HIF-1α表达的研究以人肝癌HepG2细胞为实验模型,观察物理和化学乏氧细胞中还原型谷胱甘肽（reduced glutathione,GSH）变化对HIF-1α表达的调节作用,并对其发生机制进行研究和探讨,为进一步研究GSH影响照射后乏氧细胞中HIF-1α的表达奠定实验基础。2照射后乏氧肝癌细胞中谷胱甘肽变化对HIF-1α表达的影响研究γ射线照射后乏氧HepG2细胞中GSH含量的变化以及对HIF-1α表达的影响,并对其发生机制进行研究和探讨。同时,观察HIF-1α的表达变化对乏氧细胞放射敏感性的影响。3放射抗拒细胞亚株的建立与鉴定诱导并筛选具有辐射抗拒作用的单克隆细胞亚株HepG2/R60,并对HepG2/R60细胞亚株进行形态学、生物学特性以及放射抗拒相关基因表达的鉴定,为进一步研究放射抗拒细胞中HIF-1α的表达变化构建实验模型。4放射抗拒细胞中HIF-1α的表达变化观察乏氧HepG2/R60细胞的放射敏感性变化,并检测乏氧HepG2/R60细胞和亲本HepG2细胞中HIF-1α的表达差异,以及细胞内GSH含量的变化,并对其发生机制进行初步研究和探讨。方法1谷胱甘肽变化影响乏氧肝癌细胞中HIF-1α表达的研究采用50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L三种无毒浓度的GSH合成抑制剂—丁胱亚磺酰亚胺（buthionine sulfoximine,BSO）或BSO联合5mM的GSH前体物质N-乙酰半胱氨酸（N-Acetylcysteine,NAC）预处理HepG2细胞,检测物理和氯化钴（cobalt chloride,CoCl2）化学乏氧4h后,细胞中GSH、氧化型谷胱甘肽（Oxidized glutathione、GSSG）以及GSH/GSSG比值。同时,通过逆转录聚合酶链式反应（Reverse transcriptasepolymerase chain reaction,RT-PCR）检测乏氧HepG2细胞中HIF-1α的mRNA表达变化。应用免疫印迹技术（Western blot）和免疫细胞化学技术（Immunocytochemistry,ICC）观察HIF-1α的蛋白质表达变化,并检测HIF-1α下游靶基因—血管内皮生长因子（VascularEndothelial Growth Factor,VEGF）的mRNA表达。为进一步研究GSH影响乏氧肝癌细胞中HIF-1α的作用机制,以2’,7’-二氢二氯荧光黄双乙酸钠（2′,7′-dichlorofluoresceindiacetate,DCFH-DA）为标记探针,通过流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）检测细胞内的平均荧光强度,观察乏氧HepG2细胞内ROS水平的变化。2照射后乏氧肝癌细胞中谷胱甘肽变化对HIF-1α表达的影响采用不同吸收剂量的137Cs源γ射线照射有氧、乏氧以及BSO预处理的乏氧HepG2细胞,通过细胞克隆形成实验,以多靶单击模型（single-hit multi-tarteget model）对细胞存活分数（survival fraction,SF）进行剂量效应数据拟合,计算细胞的氧增强比（oxygenenhancement ratio,OER）、平均致死剂量（D0）、准阈剂量（Dq）,观察乏氧HepG2细胞的放射敏感性变化以及GSH变化对乏氧细胞放射敏感性的影响。同时,采用GSH和GSSG检测试剂盒检测照射后细胞中GSH、GSSG和GSH/GSSG比值,通过RT-PCR、Western blot和ICC的方法观察受照乏氧HepG2细胞中HIF-1α的mRNA和蛋白质变化,进而对VEGF的mRNA表达变化进行观察,并通过FCM检测细胞中ROS水平的变化。3放射抗拒细胞亚株的建立与鉴定模拟临床放射分割照射的方法,采用137Cs源γ射线间歇照射HepG2细胞,累积剂量达到60Gy,应用Difco软琼脂法挑选单克隆细胞,继续扩大培养,传代＞50代。通过倒置显微镜和透射电子显微镜（Transmission electron microscopy,TEM）观察HepG2/R60细胞的形态学和超微结构,并与亲本HepG2细胞进行比较。采用细胞计数法对HepG2/R60细胞和亲本HepG2细胞生长曲线进行测定,以细胞培养时间为横坐标,细胞数为纵坐标,绘制细胞生长曲线,根据Patterson公式计算细胞倍增时间（Population doubling time,PDT）,并通过细胞克隆形成实验和FCM,计算HepG2/R60和HepG2细胞接种效率以及自发凋亡率并进行比较。为了鉴定所筛选的HepG2/R60细胞的放射敏感性,采用细胞克隆形成实验,计算不同剂量γ射线照射后HepG2/R60细胞的存活分数,以多靶单击模型拟合剂量效应曲线,计算HepG2/R60细胞的D0和Dq值,并与HepG2细胞比较,同时采用RT-PCR比较2Gy照射后HepG2/R60细胞和HepG2细胞内放射相关抗拒基因的表达差异,从而对HepG2/R60的细胞放射敏感性进行鉴定。4放射抗拒细胞中HIF-1α的表达变化乏氧处理HepG2/R60细胞后,通过细胞克隆形成实验,计算不同剂量照射后HepG2/R60细胞的存活分数,进行剂量效应曲线拟合,计算OER、D0和Dq值,并与相同条件下的HepG2细胞进行比较,观察乏氧HepG2/R60细胞放射敏感性的变化。采用RT-PCR和Western blot方法对乏氧HepG2/R60细胞中HIF-1α的mRNA和蛋白质表达水平进行检测,并与HepG2细胞进行比较,观察乏氧HepG2/R60细胞中HIF-1α的表达变化,并检测细胞中VEGF的mRNA表达。进而检测HepG2/R60细胞中GSH和GSSG的含量,计算GSH/GSSG比值,并与HepG2细胞进行比较,观察HepG2/R60细胞中谷胱甘肽含量的变化情况,同时,检测HepG2/R60细胞中的平均荧光强度,观察细胞内ROS含量的变化,并与HepG2细胞进行比较,对HepG2/R60细胞中HIF-1α表达变化的发生机制进行初步研究和探讨。结果1谷胱甘肽变化影响乏氧肝癌细胞中HIF-1α表达的研究不同浓度的BSO均可显著降低乏氧细胞中GSH的含量,并造成乏氧细胞中GSH/GSSG比值降低。当BSO浓度为100μmol/L时,乏氧细胞中GSH的含量下降约70%,用5mM浓度的NAC进一步处理后,可逆转BSO对乏氧细胞中GSH合成的抑制作用。根据RT-PCR结果,100μmol/L浓度的BSO能够降低乏氧细胞中HIF-1α的mRNA表达,当加入5mM的NAC后,能够部分逆转BSO对HIF-1αmRNA的抑制作用。Western blot和ICC检测结果显示,BSO为50μmol/L时即可有效抑制乏氧HepG2细胞中HIF-1α的蛋白表达,采用NAC处理可有效降低BSO对HIF-1α表达的抑制作用。对HIF-1α下游基因VEGF的检测结果表明,BSO为100μmol/L以上能够有效抑制乏氧细胞中VEGF的mRNA表达。并且不同作用浓度的BSO均能够显著提高乏氧细胞中的ROS水平,加入NAC后可有效降低乏氧细胞内的ROS水平。2照射后乏氧肝癌细胞中谷胱甘肽变化对HIF-1α表达的影响物理和化学乏氧均可有效降低HepG2细胞的放射敏感性,物理乏氧HepG2细胞的OER为2.71,而化学乏氧细胞的OER为2.17,采用不同浓度的BSO处理乏氧细胞后,可明显提高乏氧细胞的放射敏感性。在受到1-5Gy照射后2h,有氧和乏氧细胞中的GSH含量均有所增加,但乏氧细胞中GSH的升高明显高于有氧细胞,而有氧细胞中GSSG含量的升高超过乏氧细胞,并且有氧细胞中GSH/GSSG比值明显下降,呈剂量依赖模式。尽管乏氧细胞中GSH/GSSG的比值也有所降低,但下降水平显著低于有氧细胞,并且在1-5Gy范围内基本维持在一恒定水平,反之,采用BSO预处理乏氧细胞后进行照射,可明显降低GSH含量,导致GSH/GSSG比值降低。此外,受照乏氧细胞中HIF-1α的mRNA和蛋白质表达均明显高于未照射组,经不同浓度的BSO预处理后,照射后乏氧细胞中HIF-1α的表达受到明显抑制。同时受照乏氧细胞中VEGF的mRNA表达明显增加,并且VEGF的表达上调能够被不同浓度的BSO所抑制。FCM结果显示,照射后有氧细胞中的ROS水平明显增加,而乏氧细胞中的ROS水平则有所降低,采用BSO处理可明显提高乏氧受照细胞中的ROS水平。3放射抗拒细胞亚株的建立与鉴定经分割照射诱导筛选的HepG2/R60细胞表现出不规则形态,形状怪异,细胞折光度清晰,细胞集落生长缓慢。TEM观察显示细胞表面微绒毛明显增多,线粒体含量丰富,内质网增加,Golgi complex发达。同时,与亲本HepG2细胞比较,HepG2/R60细胞的PDT延长,自发凋亡率降低,接种效率明显提高。经不同剂量的γ射线照射后,HepG2/R60细胞D0值为HepG2细胞的1.35倍,Dq值为HepG2细胞的1.28倍,提示放射敏感性显著低于HepG2细胞,并且照射后HepG2/R60细胞中Rad51、XRCC4和BCL-2三种放射相关抗拒基因表达升高。4放射抗拒细胞中HIF-1α的表达变化经物理和化学乏氧处理后,HepG2/R60细胞的放射敏感性进一步降低,D0、Dq值和OER均高于亲本HepG2细胞。同时,乏氧HepG2/R60细胞中HIF-1α的mRNA和蛋白质表达水平以及VEGF表达水平均高于乏氧HepG2细胞。有氧和乏氧HepG2/R60细胞中GSH含量均有所升高,但在有氧条件下,HepG2/R60细胞的GSH/GSSG比值与HepG2细胞比较无明显差异,反之,在乏氧HepG2/R60细胞中的GSH/GSSG比值明显高于乏氧HepG2细胞,并且FCM检测结果显示,HepG2/R60细胞中的ROS水平明显降低。结论1、乏氧肝癌细胞内谷胱甘肽变化可影响HIF-1α的表达水平,其发生机制与GSH对ROS的清除能力有关。2、HIF-1α的表达水平可影响乏氧肝癌细胞的放射敏感性。3、放射可促进乏氧肝癌细胞中HIF-1α的表达,发生机制与射线造成乏氧细胞中GSH的含量变化有关。4、成功建立并筛选出具有放射抗拒作用的肝癌细胞亚株。5、乏氧可进一步降低放射抗拒细胞的放射敏感性。6、乏氧放射抗拒细胞中HIF-1α的表达水平升高,发生机制可能与GSH含量的变化有关。