视神经脊髓炎患者血清中抗水通道蛋白-4抗体的检测

论文摘要

视神经脊髓炎（neuromyelitis optica,NMO）是一种特发性中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病,根据流行病学、临床特点、影像学、病理学及实验室检查,特别是血清NMO-IgG即抗水通道蛋白-4（aquaporin-4,AQP4）抗体等资料,国外大多数学者改变了NMO隶属于多发性硬化（multiple sclerosis,MS）的传统观点,认为它有别于MS,是一种全新的中枢神经系统自身免疫通道病。目前,尚未见中国内地NMO患者血清中存在抗AQP4抗体的报道,为了调查中国内地NMO患者血清中是否存在抗AQP4抗体,本研究建立了稳定表达AQP4蛋白的HEK293细胞株。从颞叶癫痫患者脑组织提取总RNA,使用RT-PCR扩增AQP4基因,构建AQP4-GFP融合表达重组体pEGFP-N1-AQP4,转染HEK293细胞,抗生素联合流式细胞仪筛选AQP4-GFP稳定表达细胞株。结果显示,其稳定表达率达80%90%,RT-PCR和免疫荧光法证实该细胞株表达AQP4蛋白,激光共聚焦显微镜进一步确认AQP4-GFP融合蛋白主要表达于细胞膜上。在此基础上,我们收集了NMO、MS、神经系统其他疾病患者血清,并以健康正常人的血清作为阴性对照,利用已建立的稳定表达AQP4蛋白的HEK293细胞为“抗原”借助免疫荧光法检测了这些患者血清中的抗AQP4抗体。结果表明,中国内地NMO患者血清中也存在抗AQP4抗体,该方法对NMO诊断的灵敏度为88%,特异度为96.1%。为了建立适于临床推广的抗AQP4抗体简便有效的检测方法,我们初步探讨了以合成多肽为抗原的ELISA法检测NMO患者血清中的抗AQP4抗体,首次证明了AQP4蛋白细胞膜外的某些多肽段可作为ELISA检测抗原,用于检测患者血清中的抗AQP4抗体。总之,本研究证实了中国内地NMO患者血清中存在抗AQP4抗体,并初步建立了一个简便有效的NMO患者血清中抗AQP4抗体的检测方法,为我国NMO的诊疗提供了重要依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 NMO 作为一种独立疾病的证据
• 1.1.1 流行病学
• 1.1.2 临床特征
• 1.1.3 实验室检查
• 1.1.4 影像学
• 1.1.5 组织病理变化
• 1.2 自身抗体NMO-IgG 的发现
• 1.3 AQP4 蛋白：NMO-IgG 的靶点
• 1.4 AQP4 蛋白概述
• 1.5 AQP4 与中枢神经系统疾病
• 1.5.1 AQP4 蛋白与脑水肿
• 1.5.2 AQP4 蛋白与癫痫
• 1.5.3 AQP4 蛋白与其他中枢神经系统疾病
• 1.6 抗AQP4 抗体与NMO
• 1.7 NMO 的临床治疗进展
• 1.7.1 免疫抑制剂
• 1.7.1.1 糖皮质激素
• 1.7.1.2 硫唑嘌呤
• 1.7.1.3 环磷酰胺
• 1.7.1.4 醚托蒽醌
• 1.7.1.5 麦考酚酯
• 1.7.2 血浆交换
• 1.7.3 静脉注射免疫球蛋白
• 1.7.4 利妥昔单抗
• 1.7.5 免疫调节剂
• 1.7.6 治疗策略小结
• 1.8 抗AQP4 抗体的检测
• 第2章 稳定表达AQP4 蛋白的HEK293细胞株的建立与鉴定
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 主要材料与试剂
• 2.1.2 主要液体的配置
• 2.1.3 主要仪器和设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 AQP4 基因的获取
• 2.2.1.1 RNA 的提取
• 2.2.1.2 RT-PCR 获取AQP4 基因
• 2.2.2 重组质粒pEGFP-N1- AQP4 的构建和鉴定
• 2.2.3 细胞转染重组质粒pEGFP-N1- AQP4
• 2.2.4 抗生素联合流式细胞仪筛选AQP4 蛋白稳定表达株
• 2.2.4.1 HEK293 细胞G418 耐药性试验
• 2.2.4.2 G418 筛选稳定表达AQP4 蛋白的HEK293 细胞
• 2.2.4.3 流式细胞仪分选GFP 阳性细胞
• 2.2.5 RT-PCR 鉴定AQP4 基因表达
• 2.2.6 免疫荧光法鉴定AQP4 蛋白表达
• 2.2.7 AQP4-GFP 融合蛋白的细胞定位
• 2.3 结果
• 2.3.1 RT-PCR 扩增AQP4 基因
• 2.3.2 重组质粒pEGFP-N1-AQP4 的构建
• 2.3.3 重组质粒pEGFP-N1-AQP4 的鉴定
• 2.3.4 基因转染与稳定表达AQP4 细胞株的筛选
• 2.3.5 RT-PCR 鉴定AQP4 基因表达
• 2.3.6 免疫荧光法鉴定AQP4 蛋白表达
• 2.3.7 AQP4-GFP 融合蛋白的细胞定位
• 第3章 视神经脊髓炎患者血清中抗AQP4抗体的检测
• 3.1 试验样本获取
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 免疫荧光法检测患者血清
• 3.2.2 EDSS （Expanded Disability Status Scale）评分
• 3.2.3 治疗方案
• 3.2.4 统计分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 NMO 的临床特点
• 3.3.2 抗AQP4 抗体滴度和EDSS 评分
• 3.3.3 AQP4 抗体对NMO 诊断的敏感性和特异度
• 第4章 结论
• 第5章 以合成多肽为抗原的ELISA法检测NMO患者血清中抗AQP4抗体初探
• 5.1 ELISA 简介
• 5.2 模拟抗原多肽的选择
• 5.3 以合成多肽为抗原的ELISA 法试验步骤
• 5.4 结果
• 5.5 讨论
• 5.6 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果