尼罗罗非鱼GATA因子表达及其功能的初步研究

论文摘要

GATA因子是一类具有保守锌指结构域的转录因子,GATA家族成员具有2个C-X2-C-X17-C-X2-C （C为半胱氨酸,X为可变氨基酸,数值为氨基酸个数）锌指结构,并分别命名为氨基端（N）锌指和羧基端（C）锌指。GATA因子能结合位于靶基因启动子和增强子部位上的一段共同核苷酸序列[T/A（GATA）A/G],因而这类转录因子被命名为GATA转录因子。根据GATA因子的基因结构和功能,哺乳动物GATA家族的6个成员可以分为2个亚家族,即GATA1/2/3亚家族和GATA4/5/6亚家族；其中GATA1/2/3亚家族包括GATA1,2,3; GATA4/5/6亚家族包括GATA4,5,6。哺乳动物的研究表明GATA家族对类固醇发生,性别决定和分化等过程中有着不可或缺的作用。因此,本研究拟通过对尼罗罗非鱼不同时期性腺的8个转录组分析并结合Real-time PCR、原位杂交、启动子报告基因检测系统等实验方法初步研究GATA因子在尼罗罗非鱼性腺发育过程中的表达模式以及生物学功能。本研究采用生物信息学分析与转录组数据相结合的方法,以尼罗罗非鱼为研究对象,分离获得了GATA1,2a,2b,3,4,5,6,共7个GATA成员,其cDNA分别是1275、1748、1569、1841、1691、1850和3260bp；分别编码了425、463、456、444、393、384、495个氨基酸；其中GATA2a和GATA2b为硬骨鱼类特有的复制基因。对GATA家族各成员的基因结构分析发现GATA1/2/3亚家族包含5个外显子,GATA4/5/6亚家族包含6个外显子。通过生物信息学分析,我们在已公布了基因组序列的后口类非脊椎动物中只分离获得了GATA123和GATA456两类GATA基因；系统发生分析表明,GATA123与脊椎动物GATA1/2/3亚家族聚类在一起,而GATA456与脊椎动物GATA4/5/6亚家族聚类在一起；这暗示了后口动物的祖先至少具有2个分别与GATA123和GATA456直系同源的GATA基因；在进化过程中,由于脊椎动物基因组复制而产生了新的GATA家族成员。除此之外,系统发生分析还发现GATA1/2/3亚家族中脊椎动物GATA2和GATA3进化关系更为接近,而GATA4/5/6亚家族中GATA5与GATA6的进化关系更为接近。共线性分析表明在脊椎动物中GATA2和GATA3附近存在保守的共线性基因位点,同样的GATA5和GATA6附近也存在保守的共线性基因位点。因此,我们推测GATA2与GATA3以及GATA5与GATA6可能分别由一个祖先基因复制产生。通过5,30,90和180dah （days after hatching,孵化后天数）尼罗罗非鱼性腺转录组分析表明GATA家族7个成员均在5dah性腺表达,而且GATA2b,GATA4和GATA6在5dah XX性腺的表达水平明显高于在XY性腺的表达量；但是在30、90和180dah的尼罗罗非鱼性腺转录组,除了GATA6以外的其它GATA家族各成员的表达量均开始下调。5-30dah为尼罗罗非鱼性别决定和分化的关键时期,这暗示了GATA家族对尼罗罗非鱼性腺的早期发育起着重要的作用。鉴于GATA4对性别决定和分化有着重要作用,同时也为了进一步验证转录组数据的真实性,本研究采用Real-time PCR研究了GATA4在5、10、20、30、50、70dah尼罗罗非鱼性腺的表达情况,结果基本与转录组数据吻合。原位杂交结果表明GATA6在雌、雄性腺的间质细胞中表达,而已有的研究表明GATA2a、GATA2b和GATA4均在雌、雄性腺的间质细胞中表达,这表明GATA家族成员可能具有类似的细胞表达模式。有趣的是,性别分化的重要基因AMH以及类固醇合成酶基因,如CYP19、STAR1和STAR2等均在性腺的间质细胞中表达,这暗示了GATA因子可能与AMH、CYP19ala、STAR1和STAR2的表达相关。哺乳动物中的研究表明GATA4能和SF1协同作用,调控AMH、CYP19和STAR的表达。因此,本研究选取了GATA4为研究对象,通过用启动子报告基因研究GATA4对AMH、 CYP19ala、STAR1和STAR2启动子的调控作用,结果表明GATA4能激活AMH和STAR1的转录,抑制CYP19ala的转录；但是对STAR2却没有调控作用。AMH为雄性通路上的重要基因,而CYP19ala是雌雄通路上的重要基因；GATA4对AMH和CYP19ala的调控方式也进一步说明了GATA4可能在雄性通路上起着重要的作用。综上所述,本研究从尼罗罗非鱼中分离获得了7个GATA转录因子,通过生物信息学,转录组分析,原位杂交以及转录调控分析获得以下结论：1)脊椎动物的GATA因子可能由原口动物共同祖先的2个GATA基因进化而来；2)GATA2与GATA3以及GATA5与GATA6可能分别由同一个祖先基因进化产生；3)GATA4能上调雄性相关基因AMH的表达,抑制雌雄通路相关基因CYP19ala的表达,从而表明GATA4可能是雄性通路上的重要基因；4)GATA家族对尼罗罗非鱼性腺的早期发育起着重要的作用；

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1 GATA家族成员
• 2 GATA家族成员的结构
• 3 GATA因子的生理功能
• 3.1 GATA因子与性别决定和性腺的分化
• 3.2 GATA因子与类固醇发生
• 3.3 GATA因子的其他生理功能
• 4 本研究的立项依据和目的意义
• 4.1 立项依据
• 4.2 目的意义
• 第2章 尼罗罗非鱼GATA家族成员序列的分离和系统进化研究
• 1 引言
• 2分析方法
• 2.1 尼罗罗非鱼基因组本地BLAST数据库的构建
• 2.2 尼罗罗非鱼性腺的转录组测序
• 2.3 尼罗罗非鱼性腺转录组本地BLAST数据库的构建
• 2.4 尼罗罗非鱼GATA家族成员的分离
• 2.5 尼罗罗非鱼GATA家族成员序列分析
• 2.6 尼罗罗非鱼GATA家族成员的系统进化分析
• 2.7 脊椎动物GATA家族成员的共线性分析
• 3 结果
• 3.1 尼罗罗非鱼GATA家族成员序列分析
• 3.2 尼罗罗非鱼GATA家族的系统进化分析
• 3.3 GATA家族成员的共线性分析
• 4. 讨论
• 第三章 尼罗罗非鱼GATA因子的表达和功能的初步研究
• 1 引言
• 2. 材料、仪器与方法
• 2.1 主要仪器
• 2.2 实验耗材
• 2.3 有关试剂的配置
• 2.4 实验动物
• 2.5 实验方法
• 3 结果
• 3.1 尼罗罗非鱼GATA因子组织表达模式分析
• 3.2 尼罗罗非鱼GATAs和AMH在不同时期性腺的表达
• 3.3 GATA6在性腺的细胞表达类型
• 3.4 GATA4对AMH以及类固醇合成相关因子调控分析
• 4分析讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间所发表的文章
• 专利申请情况
• 在读期间参加科研情况