论文摘要
胚胎在母体内着床的过程是生命中最复杂和最神秘的过程之一，其调控机理是生物学家长期以来不懈探索的重大课题。人类胚胎滋养层细胞具有很强的侵袭能力，在胚胎植入过程中，能够突破母体子宫内膜组织并深入到子宫肌层上1／3处，即胚胎滋养细胞的侵袭是有节制性的侵袭。一般而言，细胞的侵润能力与其黏附能力是紧密关联的，滋养细胞的侵袭行为是由一个复杂的网络系统精确调控的，实际上是在甾体激素的协同作用下，通过子宫和胚胎所表达的各种细胞因子、生长因子、血管发生因子、蛋白酶类激活／抑制因子及细胞凋亡调控因子等，在时间和空间上相互协同作用下完成的，滋养层细胞侵润能力的加强常常伴随其细胞一细胞、细胞一基质间黏附特性的改变，但对此过程的了解尚处于起始阶段。米非司酮是炔诺酮衍生物，作为一种孕激素和糖皮质激素拮抗剂，临床上用于终止早孕以及作为紧急避孕药已经十余年，其临床效果得到普遍认可，但作用机制有待于进一步研究。近来研究证实米非司酮可使蜕膜组织中CD4+T淋巴细胞、CD56+CD16+NK细胞百分率升高，上调TNF-α，从而破坏局部免疫微环境。Sideu认为，米非司酮作为一种抗氧化剂通过抑制NF-κB（核转录因子）的活性从而影响MCP-1、GM-CSF、G-CSF和其它多种粘附分子的基因表达。表明米非司酮可能影响着靶器官炎症细胞的数量、淋巴细胞表型和某些细胞因子的表达。既往的研究多局限于米非司酮对子宫内膜、子宫颈、或蜕膜的个别细胞因子的影响，对滋养细胞的作用侧重于细胞凋亡方面，但米非司酮具体是如何调控母胎界面的哪些细胞因子，因子之间相互是如何作用的，对滋养细胞侵入和胚胎着床有何影响尚不清楚。环孢素A为目前公认的抑制移植排斥反应最为有效的药物，是一种具有亲脂性的环状多肽化合物，该药能通过竞争性的与细胞浆的环孢亲和素结合蛋白，从而发挥T淋巴细胞的抑制效应，阻断参与排斥反应的体液和细胞效应机制，防止排斥反应的发生。除了作用于T细胞外，环孢素A还可以抑制抗原提呈细胞，如B细胞、巨噬细胞、树突状细胞细胞表面协同刺激分子的表达及IL—12的生成，调节Th1／Th2型细胞因子的平衡。同时环孢素A损伤树突状细胞在中枢的迁移和成熟，诱导免疫耐受。2004年，美国国家移植后妊娠注册机构（USANational Transplantation Pregnancy Registry，NTPR）对1991年以来1319例器官移植后妊娠结局做了一项统计，70％以上的移植后妊娠有了健康的后代，故治疗剂量的环孢素A可安全用于妊娠期。有研究表明低剂量的环孢素A不仅对内皮细胞没有细胞毒／致凋亡作用，相反却可以增强细胞的存活与抗凋亡能力。因此推测在胚胎着床期（抗原致敏期）应用低剂量环孢素A可能对胚胎的发育具有保护作用，而不是毒性作用。但其是通过调控哪些细胞因子发挥其保护胚胎作用的，国内外尚无此类的报道。既然胚胎着床过程如此复杂，对单个或几个因子的纵向研究所提供的信息就有很大的局限性。Luminex液相芯片系统就是一个高度灵活的多元分析平台，可以适用于蛋白质组学研究，且其操作简便，灵敏度更高，信噪比好，在更低的蛋白质浓度下，曲线即呈现线性趋势。故本课题利用建立的体外人胚源性绒毛滋养细胞及母源性蜕膜基质细胞，应用Luminex xMAP技术从蛋白组学水平检测正常妊娠体系中同一样本里多个细胞因子和生长因子的表达强度及特点，减少了样本间的差异，更加接近人体的情况，以探讨细胞因子和生长因子在正常妊娠发生发展过程中的作用，寻找在人胚胎着床过程中同时起重要作用的关键性分子。分别加入米非司酮和环孢素A，研究其对母胎界面细胞因子的调控机制，为胚胎培养液的最佳成分组合提供分子理论依据，为探索发展新一代抗胚胎植入的避孕药和建立有效治疗不孕症的方法提供理论依据。第一部分人早孕蜕膜基质细胞及绒毛外滋养细胞中细胞因子表达谱的变化差异【研究目的】研究人早孕蜕膜基质细胞及绒毛外滋养细胞中IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-6、TGF-β、FGF、IFN-γ、IL-17、VEGF、EGF、Leptin表达的变化以探讨其胚胎着床的影响。【材料和方法】1．收集人正常早孕绒毛和蜕膜标本各7例，用0.25％胰蛋白酶和50Kunitz／mlDNA酶，温和消化绒毛块和蜕膜组织，培养滋养层细胞和蜕膜细胞，用2.5％-1.25％BSA纯化滋养层细胞和蜕膜细胞，去除成纤维细胞、巨噬细胞等。按1×106／ml接种于24孔培养板中培养。鉴定其纯度在95％以上后，收集培养上清液。2．倒置显微镜下观察细胞生长状态，并镜下拍照。3．用SP免疫组化染色法鉴定细胞纯度将无菌盖玻片置于培养皿中进行细胞爬片培养，待细胞爬片基本长满时，取出盖玻片，PBS漂洗5min，3次，4％多聚甲醛4℃固定30 min，以链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶（streptavidin-peroxide，SP）染色法进行染色，第一抗体分别为细胞角蛋白和波形蛋白。加酶底物DAB、H2O2显色，光学显微镜观察，阳性细胞细胞质呈棕黄色。操作按说明书进行，用PBS代替一抗做阴性对照。4．利用Luminex xMAP测定培养上清液中IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-6、TGF-β、FGF、IFN-γ、IL-17、VEGF、EGF、Leptin蛋白表达的变化。5．SPSS10.0分析11种蛋白在不同培养条件下的表达差异。【结果】1．DSC及EVCT在24孔培养板正常生长，细胞鉴定纯度均在95％以上，且生物学特性得以维持，可以用来实验。2．蜕膜基质细胞培养上清液中，细胞因子表达含量由高到低依次为Leptin、TGF-β、IL-6、IL-1ra、FGF、IL-1β、EGF、VEGF、IL-17、IL-1α、IFN-γ；绒毛外滋养细胞培养上清液中，细胞因子表达含量由高到低依次为Leptin、IL-6、TGF-β、IL-1ra、IL-1β、EGF、IL-1α、VEGF、IFN-γ、FGF、IL-17。3．绒毛外滋养细胞分泌细胞因子的表达谱与蜕膜基质细胞分泌的因子表达谱相比有明显的变化，其中IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-6、Leptin显著升高差异有统计学意义（P＜0.01）；IL-17、VEGF、FGF水平显著降低差异具有统计学意义（P＜0.01）；TGF-β、EGF、IFN-γ两者差异无显著性（P＞0.05）。【结论】1．蜕膜基质细胞、绒毛外滋养细胞中多种细胞因子的表达对于正常妊娠维持很重要，不同的因子作用各异，且通过表达量的不同而影响胚胎着床。Th1型细胞细胞因子IFN-γ，IL-17表达减低，表明母体面的免疫功能受到抑制，从而降低免疫排斥，有利于胚胎着床。IL-1ra、IL-6、Leptin升高，起保护妊娠的作用。2．Luminex液相芯片分析系统具有灵活性好、通量大、灵敏度高、信噪比好的特点，能同时检测到同一样本多个极微量的分子蛋白，比其它的检测方法具有更多优势。第二部分米非司酮对人早孕绒毛外滋养层细胞和蜕膜基质细胞细胞因子表达的影响【研究目的】研究孕激素拮抗剂米非司酮（RU486）对早孕期绒毛外滋养细胞和蜕膜基质细胞分泌细胞因子的影响以探讨其终止早孕的分子机制。【材料和方法】1．人早孕绒毛外滋养细胞和蜕膜基质细胞培养方式同前。2．同批来源的绒毛外滋养细胞培养系统分为2组，一组加入含1×10-6mol／L的RU486的无血清培养液作为实验组，一组加入不含RU486的无血清培养液作为对照组，均培养48h后收集上清液；同批来源的蜕膜基质细胞培养系统分为2组，一组加入含1×10-6mol／L的RU486的无血清培养液作为实验组，一组加入不含RU486的无血清培养液作为对照组，均培养48h后收集上清液。3．Luminex检测分别两组细胞培养上清液中11种因子（同前）的浓度。配对t检验比较各组之间因子表达量的差异，探讨RU486对母胎界面的细胞因子的影响。【结果】1．用米非司酮处理后，绒毛外滋养细胞中IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-6、Leptin、TGF-β表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；FGF表达显著升高，差异有统计学意义（P=0.000）；IL-17、VEGF、IFN-γ、EGF表达在两者之间差异无显著性（P＞0.05）。2．用米非司酮处理后，蜕膜基质细胞中IL-1β、TGF-β、EGF、Leptin表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；IL-1ra、IL-6、VEGF、FGF表达显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；IL-1α、IFN-γ、IL-17表达在两者之间差异无显著性（P＞0.05）。【结论】米非司酮通过干扰胚胎着床的物质基础，抑制滋养细胞增殖，使得妊娠保护因子／妊娠破坏因子平衡作用向妊娠破坏因子方向偏移，增强对胚胎的排斥反应，诱发绒毛和蜕膜发育障碍，导致妊娠终止。第三部分环孢素A对人早孕绒毛外滋养层细胞和蜕膜基质细胞细胞因子表达的影响【研究目的】研究免疫抑制剂环孢素A（CSA）对人早孕期滋养层细胞和蜕膜细胞分泌细胞因子的影响以探讨其在早孕中发挥作用的分子生物学机制。【材料和方法】1．人早孕绒毛外滋养细胞和蜕膜基质细胞培养方式同前。2．同批来源的绒毛外滋养细胞培养系统分为2组，一组加入含1×10-6mol／L的CSA的无血清培养液作为实验组，一组加入不含CSA的无血清培养液作为对照组，均培养48h后收集上清液；同批来源的蜕膜基质细胞培养系统分为2组，一组加入含1×10-6mol╱L的CSA的无血清培养液作为实验组，一组加入不含CSA的无血清培养液作为对照组，均培养48h后收集上清液。3．Luminex检测两组细胞培养上清液中11种因子（同前）的浓度。配对t检验比较各组之间因子表达量的差异，探讨CSA对母胎界面的细胞因子的影响。【结果】1．用环孢素A处理后，绒毛外滋养细胞中IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-6表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；IL-17、FGF、Leptin表达显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；IFN-γ、VEGF、EGF、TGF-β表达在两者之间差异无显著性（P＞0.05）。2．用环孢素A处理后，蜕膜基质细胞中IL-1β、IL-6、VEGF、Leptin表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；IL-1α、IL-1ra、IL-17、TGF-β、IFN-γ、EGF、FGF表达在两者之间差异无显著性（P＞0.05）。【结论】环孢素A通过作用于T细胞活化早期，阻断T细胞反应的不同阶段使得细胞因子向有利于妊娠的Th2偏移，对妊娠起到保护作用。