植物源农药原料林树种苦楝良种选育及其遗传多样性分析

论文摘要

苦楝（Melia azedarach Linn）是我国广泛分布的乡土树种,为生长迅速、用途广泛的多种功能综合性利用的树种,具广泛的应用前景与开发价值。以其提取物制备的杀虫剂,具有对有害生物高效、对非靶标生物安全、易分解、无残留、不污染环境和不易使害虫产生抗性等优点。但目前该树种资源极为分散,破坏严重,远远满足不了其利用的产业化要求。因此,苦楝的良种选育及其速生丰产林建设研究将成为今后的研究热点之一。本文在对福建省内苦楝资源调查的基础上,从中筛选出高川楝素含量的优树,从省外主要的苦楝分布区引进不同的地理种源,研究其幼林生长状况,进行不同造林密度的造林试验,开展扦插快繁技术研究,分析不同地理种源苦楝的营养元素、叶绿素含量变异情况,并对苦楝RAPD分子标记及其遗传多样性分析等内容进行研究。主要研究的结果如下:1、通过L9（34）正交设计试验的研究结果表明:乙醇浓度是川楝素提取测定的关键因素,其次,浸泡时间则是川楝素提取测定的第二个关键因素。其提取测定的最简便方法为:取样品5g,放入45ml的95%乙醇,在50℃下浸泡60min,重复三次。2、通过对影响川楝素含量的初选优树所在地基本气候因子的主成分分析表明,经度和海拔对川楝素含量大小影响最大。海拔有利于川楝素的积累,其川楝素含量随着经度的增加而增加的趋势。苦楝树体特征上的变异主要是树高和冠幅。3、按川楝素含量的高低,通过聚类分析,将福建省的苦楝分成四类,第Ⅰ类包括11号优树,为极高含量种源;第Ⅱ类包括8、23、27、46、49、60、66,为高含量种源;第Ⅲ类包括4、5、6、7、9、13、15、16、17、18、20、21、22、24、25、29、33、34、35、36、37、38、39、40、42、45、47、48、50、51、54、55、56、57、58、59、61、62、63、69、70、71、72号,为中等含量种源;第Ⅳ类包括1、2、3、12、14、19、26、28、30、31、41、43、44、52、53、64、65、67、68、73、74、75、76、77、78、79、80、81号,为低含量种源。根据综合性状评分复选,通过聚类分析,把81株初选优树按得分值分为4类,分别为“极高”、“高”、“中”、“低”,其中前两类共39株,为药用型苦楝优树,入选率为48.15%。4、通过反复试验,确定适宜的苦楝RAPD-PCR扩增程序为:94℃预变性2min;然后38个循环（94℃变性30s,37℃退火1min,72℃延伸80s）;最后72℃延伸8min,4℃保存。其优化的RAPD反应体系为:在总反应体系为20μL中,Mg2+浓度3.0mmol·L-1,dNTP 0.25mmol·L-1,引物浓度0.30μmol·L（-1）,模板DNA60ng,Taq DNA聚合酶用量为1U,Buffer2.0μL,灭菌ddH2O12.5μL。5、利用筛选出的20个引物和优化的RAPD反应程序和反应体系,对15个不同来源的苦楝进行RAPD分析并得到多态性。20个随机引物共扩增出193条重复性好、清晰的位点,其中多态位点共计189个,占97.9%,平均每个引物可获得9.7个位点。6、采用不加权算术平均法（UPGMA）,对15个不同来源的苦楝个体进行聚类分析,结果表明:当以遗传距离为0.60时被划分为4组:当以遗传距离为0.60时15个不同来源的苦楝个体被划分为4组。第一组为分别来自四川绵阳、云南保山、福建永泰、湖南浏阳、福建尤溪、福建建瓯、福州仓山和福建延平的1、3、9、6、11、12、13、15、14、10号,第二组包括2、4、7号,它们依次来自浙江金华、海南昌江和广西龙泉;来自江西庐山的8号被列入第三组,第四组来自广西南宁的5号种源则单列为一组。而且,同一省内的福建延平、福建建瓯、福州仓山、福建永泰和福建尤溪首先聚合,被划分为一类,说明来自同一个省的苦楝其种源起源大致是相同的。当遗传距离为0.72时又被分为两类,第一类包括第一组、第二组、第三组,第二类包括第四组。总体上来看这15份苦楝个体,在DNA分子水平上划分只能粗略地划分两个种群。7、苦楝不同地理种源的营养元素含量差异较大,枝的全N平均含量为7.178g·kg-1;枝的全P平均含量为0.826g·kg-1;枝的全K平均含量为2.511g·kg-1。叶的全N平均含量为16.067g·kg-1;叶的全P平均含量为1.165g·kg-1;叶的全K平均含量为2.540g·kg-1。枝、叶的营养元素含量均为N＞K＞P。方差分析表明,不同种源在吸收和利用营养元素能力上存在着显著差异。苦楝种源枝、叶各营养元素含量与种源地地理、气候因子相关分析结果表明,苦楝种源枝叶、各营养元素与种源地地理、气候因子的关系不太紧密。8、不同地理种源苦楝的光合作用能力上存在着显著差异。通过对成熟叶的叶绿素含量分析,结果表明:不同种源间的叶绿素含量差异达到了显著或极显著水平。苦楝不同地理种源的叶绿素含量差异较大,叶绿素a含量在0.8642至5.4768mg·g-1·FW之间,平均含量为2.7444mg·g-1·FW,叶绿素b含量在0.3574-3.5528mg·g-1·FW之间,平均含量为1.2351mg·g-1·FW;叶绿素总含量在1.2266-8.9969mg·g-1·FW之间,平均含量为3.9725mg·g-1·FW。9、在苦楝扦插的正交试验中,最佳理论组合为A2B1C1,即采用1年生的苦楝枝条用IBA300mg·L-1浸泡2h扦插效果最佳。在分别以河沙、红壤、红壤+河沙混合基质中,以红壤+河沙混合基质上扦插的效果最好。不同扦插季节的扦插效果表现为:春季（3月）＞秋季（10月）＞夏季（7月）。10、对苦楝5个种源间的地理变异规律研究表明:降水量和温度是影响苦楝生长的主要因子,苦楝幼林的树高、胸径、材积与纬度呈负相关,低纬度地区的种源在生长性状上有一定优势;而与经度的相关性呈一定程度的正相关。5个种源单株各器官生物量分配规律基本上遵循的原则为:干＞根＞枝＞叶;5个种源的3个主要生长性状的变异系数分别为35.29%,36.89%,45.75%,具较高的变异程度。5个种源的生长情况在引种地的综合表现为:江西南昌＞湖南长沙＞浙江宁海＞江苏镇江＞湖北襄阳。11、对3个不同的造林密度(1200株·hm-2、1650株·hm-2、2500株·hm-2)苦楝幼林的造林效果分析显示:树高、胸径、冠幅、材积生长最快的为1650株·hm-2,其造林的成活率和保存率,均超过90%。不同造林密度试验中苦楝平均单株生物量以1650株·hm-2的为最高,其鲜重为10.160kg,干重为3.854kg;最小的为1200株·hm-2,其鲜重和干重分别仅为8.630kg和3.504kg。总之,3个造林密度中1650株·hm-2的造林效果最好。

论文目录

• 缩略词表
• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 苦楝研究综述
• 1.1 苦楝的分布
• 1.2 生物学生态学特性
• 1.3 苦楝主要的提取物及其有效成分
• 1.4 有效成分的提取方法
• 1.4.1 溶液浸提法
• 1.4.2 索氏提取法
• 1.4.3 超临界法
• 1.4.4 微波法
• 1.4.5 超声波法
• 1.4.6 液膜萃取
• 1.5 作用机理
• 1.5.1 植物源杀虫剂
• 1.5.2 植物源杀菌（线虫）剂
• 1.6 苦楝资源的开发利用
• 1.6.1 树根、树皮
• 1.6.2 木材和木料
• 1.6.3 花、果、种子、叶
• 1.6.4 在农林业上的应用
• 2 苦楝种源选择与良种选育的研究概况
• 3 分子标记及其在林木遗传多样性与遗传育种中的利用
• 3.1 分子标记的种类及特征
• 3.1.1 限制性酶切片段长度多态性标记（RFLP）
• 3.1.2 随机引物扩增DNA多态性标记（RAPD）
• 3.1.3 扩增片段长度多态性标记（AFLP）
• 3.1.4 简单序列重复长度多态性标记（SSR）
• 3.1.5 简单重复序列间扩增（ISSR）
• 3.1.6 染色体原位杂交技术
• 3.2 分子标记在林木遗传多样性研究中的应用
• 3.2.1 遗传多样性的含义及研究意义
• 3.2.2 种亲缘关系及分类研究
• 3.2.3 林木DNA指纹图谱的构建和种质资源的鉴定
• 3.3 分子标记在林木遗传育种中的应用
• 3.3.1 数量性状的基因定位（QTL）与遗传图谱构建
• 3.3.2 分子标记辅助育种
• 4 研究存在的问题及展望
• 4.1 存在的问题
• 4.2 展望
• 5 本研究的主要内容及技术路线
• 5.1 川楝素提取方法及其含量测定研究
• 5.2 苦楝优良单株选择研究
• 5.3 苦楝种源群体遗传多样性分析
• 第二章 苦楝优树选择研究
• 1 材料与方法
• 1.1 川楝素提取方法研究
• 1.1.1 材料来源
• 1.1.2 主要实验仪器及试剂
• 1.1.3 试验设计
• 1.1.4 原料提取
• 1.2 优良种源及优良单株选择
• 1.2.1 选优林分条件
• 1.2.2 候选优树选择方法
• 1.2.3 川楝素含量的检测
• 1.2.4 对比值I的计算
• 1.2.5 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 正交试验法优选川楝素的提取工艺
• 2.2 苦楝优树选择初步研究
• 2.2.1 川楝素含量的主要影响因素分析
• 2.2.2 优树树体特征主成分分析
• 2.2.3 药用型苦楝优树选择标准的制定
• 3 小结
• 第三章 苦楝种源群体遗传多样性分析
• 1 试验地概况
• 2 材料与方法
• 2.1 苦楝不同地理种源的营养元素含量分析
• 2.2.1 样品采集
• 2.2.2 测定方法
• 2.2 苦楝不同地理种源的叶绿素含量分析
• 2.2.1 样品采集
• 2.2.2 测定方法
• 2.3 苦楝种源群体遗传多样性的RAPD分析
• 2.3.1 材料收集
• 2.3.2 主要的实验设备和试剂
• 2.3.3 RAPD分析方法
• 3 结果与分析
• 3.1 苦楝不同地理种源的营养变异
• 3.2 苦楝不同地理种源的叶绿素含量分析
• 3.3 苦楝种源群体遗传多样性RAPD分析
• 3.3.1 RAPD技术体系的建立
• 3.3.2 RAPD多态性分析
• 3.3.3 RAPD标记苦楝遗传资源的聚类分析
• 4 小结
• 4.1 苦楝不同地理种源的营养变异
• 4.2 苦楝不同地理种源的叶绿素含量变异
• 4.3 苦楝RAPD反应体系的优化
• 4.4 苦楝RAPD多态性分析
• 4.5 RAPD标记苦楝遗传资源的聚类分析
• 第四章 苦楝扦插快速繁殖技术研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 试验地自然概况
• 1.1.2 扦插材料的选取与制备
• 1.1.3 插床设置及整地
• 1.1.4 扦插及苗圃地管理
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 不同激素处理扦插试验
• 1.2.2 不同扦插基质扦插试验
• 1.2.3 不同扦插季节扦插试验
• 1.2.4 测定指标
• 2 结果与分析
• 2.1 不同激素处理扦插试验结果
• 2.2 不同扦插基质扦插试验结果
• 2.3 不同季节的扦插试验结果
• 3 小结
• 第五章 苦楝人工林栽培技术初步研究
• 1 试验地概况
• 2 材料与方法
• 2.1 苦楝实生苗的培育
• 2.1.1 苗圃地选择
• 2.1.2 种子特性
• 2.1.3 种子催芽与播种育苗
• 2.2 造林
• 2.2.1 造林地选择与整地
• 2.2.2 造林施工
• 2.3 抚育管理
• 2.4 病虫害防治
• 2.4.1 溃疡病
• 2.4.2 红蜘蛛和介克虫
• 2.4.3 锈壁虱
• 2.5 外业调查与数据分析
• 2.5.1 外业调查
• 2.5.2 数据分析
• 3 结果与分析
• 3.1 不同种源苦楝幼林生长状况
• 3.1.1 苦楝种源间的地理变异
• 3.1.2 苦楝种源间幼林生长性状差异
• 3.1.3 不同种源的苦楝单株生物量比较分析
• 3.1.4 苦楝优良种源的初步选择
• 3.2 苦楝不同造林密度的造林效果
• 3.2.1 不同造林密度苦楝幼林生长性状差异
• 3.2.2 不同造林密度苦楝幼林的单株生物量比较分析
• 4 小结
• 第六章 结论与讨论
• 1 主要结论
• 1.1 川楝素提取测定的简易方法
• 1.2 苦楝优树选择
• 1.3 苦楝RAPD反应体系的优化
• 1.4 苦楝RAPD多态性分析
• 1.5 RAPD标记苦楝遗传资源的聚类分析
• 1.6 不同地理种源苦楝的营养元素变异
• 1.7 苦楝不同地理种源的叶绿素含量变异
• 1.8 苦楝扦插快速繁殖技术研究
• 1.9 不同种源苦楝试验林生长状况初步研究
• 1.10 苦楝不同造林密度的造林试验
• 2 讨论
• 2.1 川楝素提取方法
• 2.2 优树选择方法
• 2.3 样品采集季节和采集部位的问题
• 2.4 苦楝RAPD反应体系和条件的优化问题
• 2.5 苦楝扦插快繁技术研究
• 2.6 苦楝种源试验
• 2.7 不同造林密度的造林研究
• 2.8 苦楝不同地理种源的营养变异
• 2.9 关于苦楝种质资源的保护问题
• 3 主要创新点
• 参考文献
• 附录
• 导师简介
• 博士期间发表的学术论文
• 致谢