木质素合成酶C3H基因的克隆及鉴定

论文摘要

木质素是植物体内一种重要的高分子化合物，在植物的生长发育中具有重要的生物学功能。木质素是在复杂酶系的作用下完成的，其中的香豆酸-3-羟基化酶（CoumaricAcid3-Hydroxylase,C3H）被认为是调控植物体内木质素代谢过程中各单体流向的关键酶之一。我们通过对欧美杨107的c3h基因进行克隆及功能研究，以探讨木质素单体转换的分子机理。主要研究成果如下：1.利用CTAB法提取欧美杨107的基因组DNA，通过Primer Prenier5.0软件设计了3对引物，将它们分别作为PCR扩增的特异引物，以杨树叶片DNA为扩增模板进行PCR扩增，筛选出一对合适的引物，并对其扩增条件进行优化。2.应用筛选的引物从欧美杨107的次生木质部的总RNA中通过RT-PCR扩增出一条长约1000bp在木质部中特异表达的c3h基因片段，与设计大小相符。将c3h基因克隆到pMD20-T载体上，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，获得重组质粒。重组质粒经特异引物扩增和限制性内切酶酶切鉴定后，并对重组质粒进行测序鉴定。3.通过对测序结果进行序列分析，表明其长为994bp，正向插入到pMD-20-T载体中。测序结果和已发表的NCBI核酸数据库中Anterola,A.M.等发表的火炬松（Pinustaeda）C3H的mRNA序列（AY064170）进行序列比对，结果表明，二者之间同源性为70%。扩增片段内包含一个长为495bp的开放阅读框，编码的氨基酸序列与火炬松C3H的氨基酸序列（AAL47685.1）的相似性为91%，初步断定其为c3h基因家族中的一员。该核苷酸序列已登录到国际核苷酸序列库GenBank，其登录号为AM920690。将该重组质粒命名为pMD20-T-c3h。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 前言
• 1.2 木质素的组成
• 1.3 木质素的生物合成途径
• 1.3.1 苯丙烷代谢途径
• 1.3.2 木质素生物合成的特异途径
• 1.4 木质素基因工程研究现状
• 1.4.1 苯丙烷途径的上游调控及其对植物生长发育的影响
• 1.4.2 木质素组成的调控及其对植物生长发育的影响
• 1.4.3 木质素特异合成途径的调控及其对木质素含量的影响
• 1.5 木质素在工农业生产中的应用
• 1.5.1 木质素基因工程对造纸制浆的影响
• 1.5.2 木质素基因工程在提高饲料消化率方面应用
• 1.5.3 木质素在肥料缓释以及改良土壤方面的应用
• 1.6 木质素合成酶 C3H 的研究进展
• 1.6.1 C3H 的研究进展
• 1.6.2 苯丙烷苯环 C3羟基化途径的修订
• 1.7 本题的目的及其研究意义
• 1.8 实验方案
• 第二章 107 杨基因组 DNA 的提取及 c3h 基因扩增引物筛选
• 2.1 材料和试剂
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 试剂的配制
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 107 杨树基因组 DNA 的提取
• 2.2.2 1%琼脂糖凝胶的制作
• 2.2.3 1%琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.4 特异引物的设计
• 2.2.5 杨树 DNA 的 PCR 的扩增
• 2.3 结果与分析
• 2.4 讨论
• 第三章 107 杨树次生木质部 c3h 基因的 RT-PCR 扩增及鉴定
• 3.1 材料和试剂
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 主要试剂及试剂盒
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 实验方法与步骤
• 3.2.1 欧美杨 107 号杨树次生木质部总 RNA 的提取
• 3.2.1.1 实验材料的处理
• 3.2.1.2 实验方法
• 3.2.2 目的基因的 RT-PCR 扩增
• 3.2.2.1 反转录 cDNA 第一条链
• 3.2.2.2 PCR 反应
• 3.2.3 目的片段的回收
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 总 RNA 的提取结果
• 3.3.2 目的片段的 RT-PCR 扩增结果
• 3.3.3 目的片段的回收结果
• 3.4 讨论
• 3.4.1 总 RNA 的提取
• 3.4.2 目的片段的 RT-PCR 扩增
• 3.4.3 目的片段的回收
• 第四章 重组质粒的转化与鉴定
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌种与载体
• 4.1.2 酶及化学试剂
• 4.1.3 试剂盒
• 4.1.4 主要仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 培养基的制备
• 4.2.1.1 LB 液体培养基制备
• 4.2.1.2 LB 固体培养基制备
• 4.2.1.3 LB/Amp 平板培养基
• 4.2.1.4 转化用 LB/Amp/X-gal/IPTG 平板培养基
• 4.2.2 目的片段与 pMD20-T 载体的连接
• 4.2.3 大肠杆菌 JM109 感受态细胞的制备（CaCl2法）
• 4.2.4 重组质粒的转化
• 4.2.5 重组质粒的菌落 PCR 鉴定
• 4.2.6 重组质粒的提取
• 4.2.7 重组质粒的扩增鉴定
• 4.2.8 重组质粒的酶切鉴定
• 4.2.9 重组质粒的测序鉴定分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 重组质粒的转化
• 4.3.2 菌落 PCR 筛选
• 4.3.3 重组质粒的扩增鉴定
• 4.3.4 重组质粒的酶切鉴定
• 4.3.5 重组质粒的测序
• 4.3.6 扩增的 c3h 基因目的片段与模板序列的比对
• 4.4 讨论
• 4.4.1 DNA 片段的连接以及重组质粒的转化
• 4.4.2 重组质粒的提取
• 4.4.3 重组质粒的 PCR 扩增鉴定
• 第五章 C3H 的生物信息学分析
• 5.1 前言
• 5.2 材料
• 5.3 方法
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 核苷酸序列、氨基酸序列的组成成分及理化性质分析
• 5.4.2 导肽的预测和分析
• 5.4.3 跨膜结构域的预测和分析
• 5.4.4 疏水性／亲水性的预测和分析
• 5.4.5 二级结构的预测和分析
• 5.4.6 功能域及三级结构预测和分析
• 5.4.7 欧美杨 107 的 C3H 的遗传进化分析
• 5.5 讨论
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录