湖南省肿瘤医院药品采购办湖南长沙410006
【摘要】目的：探讨放射性药物FAK抑制剂对靶向肿瘤侵袭力的作用。方法：将恶性肿瘤组织的高表达FAK作为靶点，运用计算机模拟设计，并通过化学合成新型的FAK抑制剂，筛选药物的有效性，和FAK受体的特异性相结合，设计FAK抑制剂化合物。结果：经细胞活力试验检测，显示FAK小分子抑制剂以及其稳定碘标志物对恶性肿瘤细胞毒性作用的影响差异明显（P＜0.05）。结论：在各种恶性程度高、转移能力强的肿瘤靶向示踪、放射性核素靶向治疗中，靶向结合放射性药物FAK抑制剂与FAK位点，具有较高的临床应用价值。
【关键词】放射性药物；FAK抑制剂；靶向肿瘤；侵袭力；作用
肿瘤研究领域中，有两项重要课题：一是肿瘤分子显像，二是靶向分子治疗。最新研究发现[1]：恶性肿瘤细胞特异高表达局部黏着斑激酶（FAK）在恶性肿瘤侵袭的演进过程中发挥出重要作用。理论上认为：如果阻断了FAK的表达，便意味着抑制了恶性肿瘤细胞的侵袭与转移。本文就此展开探讨。
1材料与方法
1.1材料
诺华公司对97个FAK激酶抑制剂分子进行了SD-QSAR研究[2]，获得基于配体、受体的模型，分析了激酶抑制剂分子结构和结合活性二者的关系。通过柔性对接，在活性位点上连接97个FAK抑制剂分子，同时明确了最合理的活性构象，此系列抑制剂分子在活性位点的作用与特点直观、清晰的呈现出来，为设计新型抑制剂分子提供了可靠的理论基础。本研究参考诺华公司的报道，将7H-pyrrolo作为FAK抑制剂分子的刚性骨架核心结构。
将系统搜寻法用于CoMSIA、CoMFA模型建立的过程中，形成最低能量构象。公共骨架手动叠合能量的最低构象，构建模型，将其作为设计新化合物的理论指导。本研究所用的模型有良好的预测能力和可靠性，误差极小，可为设计、合成新抑制剂分子提供指导。通过本研究模型结构的设计，得到17个FAK抑制剂化合物，具有良好的IC50值，并对其采取化学合成。
1.2FAK小分子抑制剂对细胞增殖毒性的评价
在预试验中得到96孔板每个孔内的细胞数量、宫颈癌细胞（Hela）以及卵巢癌细胞（SKOV3）的增值率。细胞种板密度：4000个/孔；细胞悬液体积：100μL；当每个孔的细胞密度达到70%~80%，而且有良好的生长状态时，开始细胞增殖毒性试验。
DMSO为阴性对照组，PF271与PF562为阳性对照组，FAK为不同梯度浓度实验组。后两者又包括6个不同的剂量组：0.8μmol/L、1.7μmol/L、3.5μmol/L、11μmol/L、33μmol/L、和100μmol/L。于37℃的细胞培养箱中培养FAK抑制剂，加入CCK8试剂，于450nm位置检测紫外吸光度值，即每个孔板中OD值的变化情况。系细胞存活率（%）=（干预组OD/未干预组OD）×100%。
1.3125I标记FAK小分子抑制剂化合物3
通过氯胺-T法对化合物3的放射性核碘素-125进行标记，将0.0343g的DMSO溶解化合物3置于PH值为7.4，浓度为0.5mol/L的PB中，再加入10μL的Na125I，最后加入氯胺-T（现配），充分振荡，应用45μL的偏重亚硫酸钠溶液将振荡反应终止[3]。
在不改变其它标记条件的前提下，改变以下标记条件进行反应：①反应时间：1min、1min、3min、4、10min；②氨氯-T的用量：22.5μg、45μg、90μg、135μg、180μg；③反应总体积：50μL、100μL、200μL、300μL、400μL，标记率的测定方法为纸层析法。
1.4125I标记化合物3的放化纯、标记率与体外稳定性的测定方法
标记化合物3的放射性化学纯度、标记率通过岛津SCL-10AvpHPLC进行检测，计算公式：（化前标志物峰计数/各峰总计数）×100%[4]；将纯化后的125I标记化合物3溶液（100μL）分别放置在四种条件下：①常温的原液；②4℃的原液；③37℃，体积增加9倍的生理盐水；④37℃，体积增加9倍的人新鲜血清；分别孵育0h、1h、2h、4h、6h、8h、24h，然后点样，采用HPLC法检测125I标记化合物3的放射性化学纯度。
1.5FAK酶活性的测定方法
采用TR-FRETFAK酶分析实验，优势是灵敏度高[5]，操作方法：取浓度500μmol/L的ATP酶2μL、浓度5μmol/L的FAK底物氨基酸2μL以及梯度浓度化合物4μL，充分混合均匀，再加入浓度0.5ng/μL的FAK酶与反应缓冲液2μL，混合物的总体积是10μL，放置于384孔板中，常温环境下孵育。酶促反应条件：反应时间1h、温度37℃。另取10μL浓度为665μmol/L的SA-XL与TK抗体，充分混合均匀，每个孔内均加入该混合物，通过EDTA让反应停止，常温条件下继续孵育1h，通过多功能酶标仪测定荧光的信号，评估酶活性。
1.6统计学方法
本研究应用SPSS19.0统计学软件进行处理，计量资料以（`x±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料以率（%）表示，组间比较进行x2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1CCK8细胞增殖毒性试验结果
生理盐水为阴性，对照组细胞有良好的生长状态；OD值相对比较高，5个平行复孔数据的稳定性理想。
阳性对照组PF271和PF562对细胞增殖产生较强的毒性作用，在0.4μmol/L的低浓度条件下，能够有效抑制恶性肿瘤细胞的增殖，细胞存活率52.00%左右；将抑制剂浓度提高到33μmol/L，细胞存活率是29.00%，提高到100μmol/L，细胞存活率为24.00%。
2.2125I标记FAK小分子抑制剂化合物3
标记率随着条件的不同而发生变化，总结规律如下：①氯胺-T的用量：22.5μg、45μg、90μg、135μg、180μg；②反应时间：1min、2min、3min、4min、10min；③反应总体积：50μL、100μL、200μL、300μL、400μL。
3讨论
125I标记化合物3是一种放射性核素，本研究对其进行了核素标记，在优化标记方法之后，获得可在肿瘤组织中浓聚的125I标记化合物3[6]。放射性核素的示踪技术具有操作方便、安全可靠、无创等显著优势，放射性核素还能发射出射线，通过电离辐射生物效应起到抑制、杀灭恶性肿瘤细胞的作用，有效规避了化疗药物引起的耐药性，提高了临床用药的安全性，从而为恶性肿瘤患者提供更加优质、有效的治疗方案，在抗肿瘤生物治疗方面具有极高的研究价值。
参考文献：
[1]卢霞，王荣福，张华北等.放射性药物FAK抑制剂靶向肿瘤侵袭力的作用研究[J].肿瘤学杂志，2015，21（4）：264-269.
[2]练小燕.放射性药物输送盒的设计与应用[J].护士进修杂志，2017，32（15）：1438-1439.
[3]刘秀芹，郭悦，赵洪山等.放射性药物活度测量和注射方式的研究[J].中国医学装备，2017，14（3）：101-104.
[4]杨春慧，梁积新，沈浪涛等.68Ga标记放射性药物的制备及应用研究进展[J].同位素，2017，30（3）：209-218.
[5]何雅静.SPECT检查中静脉注射放射性药物的重点环节及防护措施[J].护理研究，2014，28（11）：1372-1373.
[6]安全，张伟，秦秀军，李炜宾，闻建华.放射性药物安全评价实验室的防护与管理[J].癌变.畸变.突变，2014，26（02）：154-156.