MiRNA-224参与小鼠卵泡发育调控作用的研究

论文摘要

转化生长因子β（TGF-β）超家族成员在哺乳动物生殖过程中发挥非常重要的作用,包括影响卵泡早期发生、颗粒细胞增殖和分化、卵母细胞成熟、胚胎着床以及妊娠维持等一系列生殖事件。TGF-β信号通路异常会导致雌性不育。MicroRNAs （miRNAs）是最近发现的一类小的非编码RNA,主要通过转录后的调控方式抑制或促进基因表达。然而,目前关于miRNAs参与介导TGF-β在生殖过程中的作用未见报道,如对颗粒细胞增殖和激素分泌以及COC扩展等的影响。在本研究中,我们首先检测了TGF-β1刺激小鼠腔前卵泡颗粒细胞的miRNAs表达变化情况,结果发现其中有3个miRNAs显著上调,13个miRNAs发生显著下调。在所有上调的miRNAs中,miR-224是其中第二个上调最为显著的一个miRNA。这种上调效果可以通过在颗粒细胞培养基中加入SB431542而阻断,其中SB431542是一种能够阻断TGFβ下游Smad2/3发生磷酸化的抑制剂,表明TGF-β1促进颗粒细胞miR-224的上调至少部分是通过经典的TGF-β/Smads信号通路。通过对miR-224靶基因的筛选,我们鉴定出smad4是miR-224的一个靶基因。在颗粒细胞中过表达miR-224可以增强TGF-β1对颗粒细胞增殖的促进作用,这种作用至少部分是通过靶向于smad4实现的。而使用miRNA抑制剂将内源性的miR-224水平敲低则可以部分抑制TGF-β1对颗粒细胞增殖的促进作用。此外,我们发现miR-224和TGF-β1都具有影响颗粒细胞雌二醇分泌的功能。通过real-time PCR分析表明,miR-224和TGF-β1促进雌二醇分泌的作用可能是通过促进cyp19a1基因表达实现的。这是首次发现miRNAs可以通过参与TGF-β1对颗粒细胞增殖和卵巢雌激素分泌而实现对生殖过程的调控。通过对TGF-β1刺激小鼠颗粒细胞的mRNA表达谱分析,我们发现大量mRNA表达水平发生显著变化,其中463个mRNAs显著上调,440个mRNAs出现显著下调。在上调的mRNAs中,上调最为显著的一个基因是ptx3。考虑到ptx3是COC扩展的一个标记基因,所以推测TGF-β1可能会通过调节Ptx3的表达参与卵泡后期发育。所以,ptx3基因成为我们的研究重点。在对ptx3 3’UTR片段的分析中,我们意外地发现此前研究的miR-224在其中具有保守的结合位点。随后通过荧光素酶报告基因检测和酶联免疫吸附实验都证实ptx3确实是miR-224的靶基因。进一步的研究发现,在小鼠壁层颗粒细胞和卵丘细胞中,TGF-β1同样促进了ptx3的表达,但却抑制miR-224的表达。通过分离COC进行体外培养,我们发现TGF-β1促进了卵丘扩展四个标记基因（ptx3, ptgs2, tnfaip6和has2）的表达水平,提示TGF-β1可能与卵丘扩展有关。所以,我们推测TGF-β1可能正是通过对miR-224和ptx3表达的精密调节从而实现对卵泡发育过程的调控。然而对于miR-224是否通过对ptx3表达调控进而影响COC扩展、受精及胚胎发育等都有待于进一步研究。综合以上研究结果,我们认为miR-224正是通过靶向于不同的靶基因实现TGF-β1对卵泡发育调节的介导作用。而对miRNA参与卵泡发育过程的进一步研究将会为人工干预生殖过程提供研究基础,如治疗生殖紊乱等。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 TGF-β超家族与卵巢卵泡发育
• 1.2.1 TGF-β信号传导途径概述
• 1.2.2 原始卵泡生长启动
• 1.2.3 初级卵泡发育为早期有腔卵泡
• 1.2.4 有腔卵泡生长和优势卵泡选择
• 1.2.5 排卵和黄体形成
• 1.2.6 小结
• 1.3 miRNA参与雌性生殖过程
• 1.3.1 miRNA 生成及其作用机制
• 1.3.2 卵巢miRNA 研究
• 1.3.3 miRNA 与输卵管
• 1.3.4 miRNA 与子宫
• 1.3.5 miRNA 与卵母细胞成熟、受精和胚胎发育
• 1.3.6 miRNA 与性腺激素
• 1.3.7 miRNA 与卵巢癌
• 1.3.8 小结
• 第二章 研究工作结果与讨论
• 2.1 MicroRNA-224 通过靶向于Smad4 参与TGF-β1 介导的小鼠颗粒细胞增殖和雌激素分泌
• 2.1.1 背景介绍
• 2.1.2 实验结果
• 2.1.2.1 小鼠GCs 中miR-224 表达受TGF-β/Smads 途径调控
• 2.1.2.2 miR-224 参与TGF-β1 介导的GCs 增殖和雌激素分泌
• 2.1.2.3 Smad4 是miR-224 的一个靶基因
• 2.1.3 结果分析与讨论
• 2.2 MiR-224 参与调控卵泡不同发育阶段TGF-β1 对PTX3 基因表达的影响
• 2.2.1 背景介绍
• 2.2.2 实验结果
• 2.2.2.1 TGF-β1 刺激小鼠颗粒细胞后Ptx3 基因表现上调
• 2.2.2.2 Ptx3 是miR-224 的一个靶基因
• 2.2.2.3 TGF-β1 对miR-224 表达影响具有卵泡发育阶段特异性
• 2.2.3 结果分析与讨论
• 第三章 实验材料与方法
• 3.1 试验动物
• 3.2 试剂、细胞和细胞培养
• 3.3 COCs和卵丘细胞的分离培养
• 3.4 MiRNA/mRNA 微阵列分析和生物信息学预测
• 3.5 质粒构建
• 3.6 转染和荧光素酶活性分析
• 3.7 细胞增殖检测和激素测定
• 3.8 酶联免疫吸附检测（Elisa）
• 3.9 实时定量PCR分析（real-time PCR）
• 3.10 免疫印迹分析（Western blotting）
• 3.11 免疫组化和原位杂交
• 3.12 统计分析
• 参考文献
• 附录 1 所获奖励和参加会议情况
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文与取得的研究成果