放线菌NB-8发酵条件优化及抑菌机理的研究

论文摘要

马铃薯（Solanum tubersum L.）是茄科茄属多年生草本块茎植物,我国是世界最大的马铃薯生产基地之一。马铃薯用途广泛,经济价值高,现已成为世界上仅次于水稻、小麦、玉米的第四大粮食作物。由致病疫霉（Phytophthora infestans （Mont.）de Bary）引起的马铃薯晚疫病是危害马铃薯最严重的植物真菌病害之一,常造成马铃薯产量和品质的大幅度下降甚至绝收。目前主要通过化学农药对马铃薯晚疫病进行防治,但是化学农药严重污染水体、大气和土壤,并通过食物链进入人体,危害人群健康。利用生物防治病害,有望弥补或克服上述缺陷,因而生物防治具有广阔的发展前途。本实验室前期从宁波土壤中已经筛选出一株对致病疫霉都有明显抑制作用的放线菌菌株NB-8,其活体和发酵液抑菌率分别达到92%和80%,并鉴定该菌株为白色链霉菌,抑菌活性成分为非碱性水溶性抗生素。但在后期的连续实验研究中发现,该菌株的抑菌率有所下降,最低时只有55%,本研究从进一步开发利用该拮抗放线菌防治马铃薯晚疫病的角度出发,利用单因素实验与正交试验对放线菌NB-8的发酵条件进行优化并筛选出最佳培养基。同时研究了NB-8菌株以及发酵液的抑菌谱,并初步分析了受NB-8发酵液不同抑制部位的致病疫霉恢复生长后菌丝体内SOD、PAL、CAT活性与MDA含量、可溶性蛋白含量的变化。实验结果如下:1.优化了放线菌NB-8菌株最佳发酵条件:取NB-8菌株经高氏一号液体培养5d的种子液,以125mL/250mL的装液量和1.5%的接种量,在初始pH7.0、34℃、50 r/min及12h黑暗/12h间歇光照条件下培养10d所得发酵液对致病疫霉的抑制作用最强,抑菌率达到81%。比优化前提高20%。2.以高氏一号为基础筛选出了放线菌NB-8菌株最佳培养基:最适碳源为乳糖、最适氮源为酵母汁浸膏,NaCl浓度为10g/L。在单因素实验的基础上进行正交试验最佳培养基组合为乳糖浓度为10g/L,酵母汁浸膏浓度为4g/L,K2HPO4浓度为0.5g/L,MgSO4浓度为1.0g/L。在此基础上抑菌率达到89%。3.明确了发酵液的最适抑菌浓度和稳定性。发酵液浓度在5.3-84.8 mg/mL范围内发酵液的抑菌活性随浓度的升高而提高,稀释2倍（5.3 mg/mL）时抑菌率最低为70.21%,浓缩8倍（84.8mg/mL）的发酵液的抑菌率最高,达到95.78%。发酵液适合4℃长期贮存,对发酵液的抑菌效果随着贮存时间的延长总体呈下降趋势,贮存12个月后抑菌率仍在75%以上。发酵液对MgSO4、MnSO4、K2HPO4、（NH4）2SO4等大部分盐具有很好的稳定性,发酵液受ZnCl2影响最大但抑菌率依然在64%以上。4.初步明确了NB-8菌株以及发酵液的抑菌谱。NB-8菌株活体对22种供试真菌中的11种抑制率达到50%以上,其中对梨黑斑病菌、白菜黑斑病菌、YH-1的抑制作用最强,抑菌率在70%以上。但是NB-8菌株的发酵液除对番茄灰霉病菌有较强抑制作用外,对大部分供试真菌的抑制作用很差。NB-8发酵液对供试的大多数细菌都有比较明显的抑菌作用。其中对八叠球菌和纳豆杆菌的抑制效果最好,抑菌圈直径都在20mm以上。对其他几种细菌除对SR13无抑制作用外,抑菌圈直径也都达到12mm以上。5.初步明确了NB-8发酵液对致病疫霉的部分抑制作用机理,发酵液对致病疫霉菌丝的抑制作用时间较短,生长7天菌落直径已与对照相近。受NB-8菌株发酵液抑制的菌丝体粗细不均匀,细胞壁粗糙,内含物聚集。受NB-8发酵液抑制的不同部位（分别距离抑菌带边缘0、10和20mm）的致病疫霉恢复生长7天后,与正常生长状态的菌丝相比,受抑制的菌丝体内SOD、CAT、PAL3种酶活及MDA、可溶性蛋白含量都明显下降。其中MDA含量和SOD酶活下降幅度最大,分别下降了60-90%和53-85%,可溶性蛋白含量下降55-64%,PAL活性下降48-56%,CAT活性下降38-64%。这与植物受侵染或胁迫后相关酶活性增加相反。而不同受抑制部位的菌丝恢复生长后可溶性蛋白含量、MDA含量、PAL、CAT、SOD酶活性有所变化,但是变化不大。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 马铃薯晚疫病
• 1.1.1 概述
• 1.1.2 发病条件及发病规律
• 1.1.3 马铃薯晚疫病症状
• 1.1.4 致病疫霉
• 1.2 马铃薯晚疫病的防治
• 1.2.1 农业措施防治
• 1.2.2 抗病品种的选育
• 1.2.3 化学防治
• 1.2.4 生物防治
• 1.3 生防菌发酵条件
• 1.4 本研究的目的与意义
• 第2章 生防菌NB-8 发酵条件的优化
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 实验试剂
• 2.1.4 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌种活化
• 2.2.2 发酵液抑菌活性的测定
• 2.2.3 发酵条件的优化
• 2.2.4 发酵培养基的筛选
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 放线菌NB-8 发酵条件优化
• 2.3.2 发酵培养基的筛选
• 2.4 讨论
• 第3章 NB-8 发酵液的稳定性及抑菌谱
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 供试菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 发酵液浓度对抑制致病疫霉活性的影响
• 3.2.2 存放时间对发酵液抑制致病疫霉活性的影响
• 3.2.3 盐离子对发酵液抑制致病疫霉活性的影响
• 3.2.4 NB-8 菌株及发酵液抑菌谱测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 发酵液浓度对抑制致病疫霉活性的影响
• 3.3.2 存放时间对发酵液抑制致病疫霉活性的影响
• 3.3.3 盐离子对发酵液稳定性的影响
• 3.3.4 NB-8 活体抑菌活性测定
• 3.3.5 NB-8 发酵液对真菌的抑制作用
• 3.3.6 NB-8 发酵液对细菌的抑制作用
• 3.4 讨论
• 第4章 NB-8 发酵液对致病疫霉的抑制作用及抑菌机理的研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 供试菌种、培养基
• 4.1.2 实验试剂
• 4.1.3 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 NB-8 发酵液对致病疫霉拮抗方式及持效时间的影响
• 4.2.2 NB-8 发酵液对菌丝形态的影响
• 4.2.3 受抑制的致病疫霉菌丝细胞内酶液的制备
• 4.2.4 酶活测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 NB-8 发酵液对致病疫霉拮抗方式及持效时间的影响
• 4.3.2 NB-8 发酵液对菌丝形态的影响
• 4.3.3 发酵液对致病疫霉体内酶活性变化的影响
• 4.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间取得的科研成果