深圳地区柯萨奇病毒A组16型的分子流行病学研究及RT-LAMP检测方法的建立

论文摘要

研究背景和目的儿童手足口病（hand-foot-mouth disease, HFMD）是一种常见的传染性强、传播途径复杂、在短时间内可造成较大规模流行病毒感染性疾病,其主要病原体是柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16, CA16）和肠道病毒71型（Enterovirus71,EV71）。大多数HFMD患者症状轻微,主要以手,足、口等部位皮肤粘膜的疱疹、溃疡为主要特征,伴有全身症状如发热、厌食、乏力、精神萎靡等。少数患儿可出现中枢神经、呼吸系统损害,引发脑炎、急性弛缓性麻痹、脑水肿、肺水肿和心肌炎等,个别重症患儿病情进展快,易发生死亡。EV71由于能引起严重的神经系统相关症状而得到高度重视,对其研究也较为深入。相反,CA16却由于引起较轻的临床症状不受关注,一直被作为需要与EV71鉴别诊断的病毒附带进行研究,流行病学资料很少,也没有统一的基因分型标准。然而,近年已有报道指出CA16感染可能与心肌炎、心包炎及其它严重疾病有关,甚至还可引起成人致死性肺炎。因此,开展CA16感染的流行病学研究,可为防控CA16病毒引起的相关疾病提供基础信息。基于此,本研究拟对2005-2009年期间深圳市的HFMD患者进行CA16病原学检测,对CA16分离株VPl区进行核苷酸序列测定,并与国内外CA16毒株进行同源性分析,旨在了解深圳地区CA16病毒的流行情况及基因型特征,以期为HFMD的综合防治和CA16病毒的动态监测提供依据,并丰富CA16毒株基因库及分子流行病学资料。CA16常规检测方法主要有病毒分离、免疫组化、中和试验及逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）.经典的细胞分离培养、特异性抗体检测方法步骤烦琐,检测周期长,而且一些肠道病毒难以在细胞中进行增殖,容易出现漏检；基于CA16核酸扩增的分子生物学诊断技术如PCR、RT-PCR、Real-Time RT-PCR （real-time fluorescent RT-PCR）等在病原微生物的检测以及疫病诊断方面发挥着重大作用,克服了以上缺点,敏感度、特异性较高,已成为目前CA16快速诊断的重要手段,但这些方法或者需要精密控温设备和高级复杂的分析仪器,或者对操作人员的熟练度和专业水平要求比较高,且反应时间长,不利于现场样品的检测,不利于在基层推广,无法满足简单、快速、准确诊断的要求,而疫病的防控和治疗的关键在于对病原微生物的快速、准确、及早的检测并确诊。因此,建立一种快速、准确的新型诊断技术对于CA16的诊断就显得尤为重要。环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）技术是Notomi等2000年建立的一种新的核酸扩增方法。其原理是利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）和两对特殊的引物,特异地识别靶序列上的6个独立区域,在等温条件下（65℃左右）保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应。反应结果可直接靠扩增副产物焦磷酸镁的沉淀浊度进行判断,也可以由添加SYBR Green I、溴化乙啶（EB）或其它核酸染剂进行呈色后观察。其优点是特异性强,扩增效率高,反应灵敏,操作简单。LAMP技术目前已被国内外学者应用到多种细菌及病毒的基因检测中,但至今尚未检索到使用该技术检测CA16的报道。本研究拟建立CA16病毒逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）技术,并比较该技术与RT-PCR及Real-Time RT-PCR对深圳市临床诊断HFMD患者标本的CA16基因检测效果,旨在为临床CA16感染诊断寻求快速、简便、可行的新方法。方法1．CA16病毒分子流行病学特征首先用荧光RT-PCR方法对深圳地区2005-2009年5年间所有HFMD病例进行CA16病毒快速检测,再选取每年具有代表性的阳性株用CA16特异性引物对VPl基因进行RT-PCR扩增,阳性扩增产物用于核苷酸序列测定,所得的序列与CA16各基因型代表株进行比较,用DNASTAR和Mega 4.1软件进行种系进化分析。2.CA16病毒RT-LAMP检测方法的建立首先针对CA16VP1区保守序列设计RT-LAMP引物,对引物进行反复筛选,选择最优引物组合,其次对反应体系进行优化,再对优化的RT-LAMP体系进行灵敏性、特异性、重复性实验验证,并运用于临床样本检测,初步评价CA16 RT-LAMP检测技术的可操作性。结果：1．CA16病毒分子流行病学特征分析2005年～2009年共收集HFMD患者标本1161份,CA16检出占HFMD患者的21.4%,每年的检出率分别为：2005年27.0%,2006年51.6%,2007年27.6%；2008年17.8%；2009年17.0%。主要引起5岁以下儿童（92.7%）的感染,男女性别之间发病差异无统计学意义（P=0.469）,发病高峰为每年的夏秋季节,病例大多集中在3-6月,9-11月还有一次小流行,龙岗区、宝安区（郊区）的发病显著高于福田区、南山区、罗湖区、盐田区（城区）。本研究选取的69株CA16深圳分离株VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为96.8%和99.9%。基于25株深圳代表株与38株国内国际参考株的比较分析,参考EV71分型标准及Perera等的CA16分型标准,CA16可分为A、B两种基因型,B型可分为B1、B2亚型,B2亚型又可分为B2a、B2b、B2c基因亚群,之前报道的B和C基因型应归于同一B基因型下二个分支,B基因型应该归于B1基因亚型,C基因型应该归于B2基因亚型。各基因型间氨基酸变异位点分析未发现特异性突变。2005-2009年深圳分离株在CA16进化树上分别位于B2a（66.7%）和B2b（33.3%）分支上,且与同一时期同一基因型别国内国际CA16分离株的同源性较高。2.CA16病毒RT-LAMP检测方法建立的RT-LAMP检测方法快速、简便、成本低,反应在60min内完成,与Real-time RT-PCR和常规RT-PCR相比,分别节省了近30 min和90 min。本方法检测极限是81拷贝/管,与Real-time RT-PCR比较,敏感性相同,均比普通RT-PCR方法高10倍。本法有较高的特异性和重复性,未发现假阳性结果。临床标本的检测结果与Real-time RT-PCR检测结果具有良好的一致性。结论：1.2005年～2009年,深圳市HFMD患者的CA16检出率为21.4%,CA16是该期间HFMD的主要病原之一；CA16主要感染5岁以下儿童,男女性别之间发病没有显著性差异；发病高峰为每年的夏秋季节,病例大多集中在3-6月,9-11月还有一次小流行；郊区CA16感染显著高于城区。2.深圳市检测到的CA16可分为A、B两种基因型,B型可分为B1、B2亚型,B2亚型又可分为B2a、B2b、B2c基因亚群,之前报道的B和C基因型应归于同一B基因型下二个分支,B基因型应该是B1基因亚型,C基因型应该是B2基因亚型。各基因型间氨基酸变异位点分析未发现特异性突变,说明CA16的进化速度缓慢；69株深圳分离株基因型别为B2a和B2b,其中B2a有46株,占66.7%,B2b有23株,占33.3%；69株CA16深圳分离株VP1区核苷酸和氨基酸同源性均较高,且每年分离株组内核苷酸和氨基酸同源性均较高。3.首次针对CA16的VPl基因设计RT-LAMP引物,建立了RT-LAMP方法,并对其特异性和敏感性进行了验证。4.本研究建立的RT-LAMP方法在反应时间方面,比RT-PCR快近90 min,比Real-time RT-PCR快30 min；在单样本检测成本方面,比Real-time RT-PCR低约4倍,比RT-PCR低2倍。5.本研究建立的RT-LAMP方法对临床诊断HFMD患者标本进行CA16基因检测结果与Real-time RT-PCR结果具有良好的一致性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 第一节 柯萨奇病毒A组16型的研究现状和意义
• 第二节 逆转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）
• 第三节 课题的研究意义
• 第二章 深圳地区柯萨奇病毒A组16型的分子流行病学研究
• 第一节 实验材料和方法
• 第二节 实验结果
• 第三节 讨论
• 第四节 结论
• 第三章 柯萨奇病毒A组16型RT-LAMP检测方法的建立
• 第一节 实验材料和方法
• 第二节 实验结果
• 第三节 讨论
• 第四节 结论
• 全文小结
• 参考文献
• 附录一 英文缩写注释
• 附录二 深圳市肠病毒标本送检单
• 附录三 2010年度全国法定传染病报告发病、死亡统计表
• 附录四 CA16深圳分离株
• 附录五 用于遗传进化树的CA16其他参考毒株
• 攻读硕士学位期间完成和发表论文情况
• 致谢
• 统计学审稿证明