论文摘要
在对非哺乳类脊椎动物的性别决定与分化机制的研究中,两栖类的研究明显落后于其他类群。目前的研究资料表明,遗传基因可能是大多数两栖类性别发育的主要因素。中华大蟾蜍（Bufo bufo gargarizans）分布广泛,是国内研究两栖类时常用的实验动物,其性别决定、性别分化相关基因迄今未见报道。Dmrt和Sox基因家族是脊椎动物中参与发育的两大基因家族。本文研究了中华大蟾蜍的Dmrt基因和Sox基因,研究结果如下:1. Dmrt基因家族是一个与性别发育相关的基因家族。该家族成员都含有一个具有DNA结合能力的高度保守的DM结构域,在性别决定和分化发育的调控中担负着重要的功能。本文采用简并PCR技术,对中华大蟾蜍Dmrt基因的DM域进行了扩增、克隆、SSCP筛选和序列分析,结果获得了4个Dmrt基因家族成员的7条DM序列,且无性别差异。BLAST分析发现与人类相应DMRT蛋白氨基酸序列的一致性分别为97%,97%,93%,95%,100%,97%,91%,根据中华大蟾蜍拉丁学名,将其分别命名为BgDmrt1,BgDmrt2,BgDmrt3a,BgDmrt3b,BgDmrt3c,BgDmrt5a,BgDmrt5b。研究结果显示,在中华大蟾蜍基因组中存在着Dmrt基因家族的多个成员。系统发生分析表明,该基因家族至少具有7个成员基因,在脊椎动物和非脊椎动物中都具有高度的进化保守性。2. Sox家族成员的典型特征是编码的蛋白质都具有一个保守的基序HMG-box,可以与DNA序列特异性结合,促进基因的转录,从而在性别决定及胚胎发育中起着重要的调控作用。其成员之一Sox9基因在不同分类地位的脊椎动物中具有进化保守性,是一个重要的转录调控因子,参与性别发育及软骨等多种组织和器官的发育过程。本文运用RT-PCR从中华大蟾蜍精巢中分离到了Sox9基因,总长1448 bp,编码框全长1443 bp（481个氨基酸）,其中在N端103181位共79个氨基酸为高度保守的HMG盒,C端373481共109个氨基酸为比较保守的TA域。系统树分析进一步证实了本文获得的是Sox9基因。将中华大蟾蜍Sox9蛋白序列与七种动物Sox9的氨基酸序列相比较发现,它们的同源性高达80%以上（如与人的同源性为81%,与日本粗皮蛙的同源性为92%）,显示Sox9基因在进化中比较保守。在中华大蟾蜍的精巢中检测到Sox9 mRNA的表达暗示该基因可能参与了该物种的性别发育过程。3.构建cDNA文库及从中筛选克隆基因是获得基因的一种可靠方法。本文运用SMART技术构建了中华大蟾蜍精巢全长cDNA文库。提取精巢总RNA,用Clontech公司SMARTTM cDNA文库构建试剂盒反转录合成第一链cDNA,LD-PCR扩增获得全长双链cDNA;经SfiⅠ酶切、层析柱分离后,500 bp以上的片段与λTriplEx2载体连接并包装,建成原始文库。经鉴定原始文库滴度为2.21×106pfu/ml,重组率为91%;文库扩增后的滴度为2.94×109pfu/ml,重组率为93.7%。插入片段大小分布于0.42.0 kb之间,平均长度约为1.0 kb,说明已构建文库质量较高,为进一步筛选、克隆精巢特异表达基因奠定了基础。从该文库中克隆到了泛素延伸蛋白基因,全长561 bp,包含完整的5’和3’非编码区,编码128个氨基酸,即泛素的76个氨基酸后融合了52个氨基酸的核糖体L40蛋白。