鱼类病毒性神经坏死病的病原学研究及检测方法的建立

论文摘要

鱼类病毒性神经坏死病（Viral nervous necrosis,VNN）又称脑病和视网膜病（Viral encephalopathy and retinopathy,VER）,是由鱼类病毒性神经坏死病毒（Viralnervous necrosis virus,VNNV）引起的鱼类传染病,该病对仔鱼和幼鱼危害很大,严重者在一周内死亡率可达100%,对成鱼也有很高的致死率。由于其极高的传染性和危害性,被国际兽医组织（OIE）列为重要的鱼类病害（OIE,2001）。VNNV属于诺达病毒科β诺达病毒属,是迄今发现的最小鱼类病毒。VNNV能引起尖吻鲈、赤点石斑鱼、棕点石斑鱼、巨石斑鱼、红鳍多纪鲀、条斑星鲽、牙鲆和大菱鲆等多种海水鱼类中枢神经组织和视网膜的空泡化。目前该病毒引起的疾病在除非洲以外的世界其它地方迅速蔓延开来,给各国海水养殖业造成了巨大的损失,受感染的鱼类已达40余种。我国沿海大规模网箱养殖的石斑鱼,由于受神经坏死病毒的感染,给育苗生产带来极大的损失。然而,目前对VNN开展的研究很少,其病毒特性、检测方法、预防和治疗等方面急需进行深入的研究。鉴于这种状况,我实验室从2005年开始,对我国海水鱼类进行VNNV监测,从福建等地养殖石斑鱼体内分离到6株VNNV,并对病毒特性、VNNV检测方法、疫苗设计等方面进行了研究,主要研究内容如下:1.收集福建、广东、海南三地渔场的患病石斑鱼苗,对石斑鱼苗做组织切片,在脑和视网膜中可见有大量的空泡。细胞敏感性实验表明病鱼组织匀浆后接种到条纹月醴细胞系（striped snakehead,SSN-1）后,有9株可以引起SSN-1产生CPE,毒株传代3天左右细胞质开始出现空泡化,接种石斑鱼吻端细胞Grouperproboscis（GP）、鲤鱼上皮瘤细胞（epithelima popuasum cuprini,EPC）、肥头鲤细胞（pimephales promelas,FHM）在28℃、25℃、20℃时都没有细胞病变（CPE）出现。取接种VNNV的SSN-1细胞培养物,抽提病毒总RNA进行逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测,有6株可扩增出VNNV特异性条带,验证了该毒株为VNNV病毒,分别编号为SSS0602-0607。脂溶剂敏感试验（氯仿处理）,热敏感试验（55℃30 min）,酸碱敏感试验（pH=3和pH=11各1 h）的结果表明此毒株对氯仿不敏感,对热和酸碱都比较敏感。2.选用本室分离保存的VNNV-SSS0602作为制备免疫原的材料,与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂乳化后,免疫Balb/c小鼠,取免疫鼠脾脏,分离脾细胞,与瘤细胞（SP2/0）融合后,用ELISA对细胞培养上清及杂交瘤细胞诱导的腹水检测,得到了3株可以稳定分泌抗VNNV特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株即2-D5、2E8和4F4。选取2E8作为包被材料建立了VNNV病原检测ELISA方法,分别用该ELISA方法对VNNV及其它鱼类病毒阳性样品检测,表明该方法具有很好的特异性。用该ELISA方法对366份临床样品进行检测,同时用RT-PCR作为对照方法,结果表明该ELISA方法的特异性和敏感性分别为97.6%和91.4%;ELISA和RT-PCR两种方法检测结果的符合率为94.3%。该方法的建立,为VNNV的快速检测提供了可靠的方法,为VNNV的控制及净化养鱼环境提供了方便。同时,该方法可以在进出境检疫中,对批量鱼样品的检测。3.本研究根据GenBank中登录的鱼类神经坏死病毒CP基因序列,选择高度保守区域设计引物和TaqMan荧光探针,通过对实时荧光RT—PCR反应条件进行优化,建立了用于检测的实时荧光RT—PCR方法。利用该方法检测鱼类神经坏死病毒及其它多种常见的水生动物RNA病毒,结果只能检测到目的病毒,表明其具有良好的特异性。灵敏性试验发现,其最低检测限可达1.2pg/μL的总RNA,与普通RT-PCR的灵敏度对比试验表明,该方法的敏感度很高。对同一样品进行检测,在组内及组间的变异系数分别为0.9%以及1.5%,证实其重复性极好,并且从抽提核酸到得出结果仅需4h。对临床500份样品进行鱼类神经坏死病毒检测,结果发现40份阳性样品。这些结果表明,本研究所建立的实时荧光RT—PCR能对鱼类神经坏死病毒进行准确、快速的检测,具有特异性好、灵敏度高的优点。4.从本室分离到的6株VNNV提取病毒基因组RNA。根据已报道的RNA2片段全序列设计引物,用RT-PCR方法特异性扩增出6株病毒的衣壳蛋白基因片段,分别连接到PMD18-T载体中,并进行序列测定和分析。结果发现,6个VNNV分离株的RNA2片段核苷酸序列的同源性在96.1%以上;推导的氨基酸序列同源性在79.6%-99.1%之间。根据RNA2片段核苷酸序列绘制的分子进化树表明,6个VNNV分离株在进化树同一分枝上,属于RGNNV基因型,与已报道的点带石斑鱼神经坏死病病毒（ECNNV）、巨石斑鱼神经坏死病病毒（ETNNV）及玛拉巴石斑鱼神经坏死病病毒（MGNNV）亲缘关系较近。试验结果表明,我国沿海养殖场发生的鱼类病毒性神经坏死病均由同一来源的病毒引起的,该基因型的鱼类神经坏死病毒在我国沿海养殖的石斑鱼中传播流行,并造成了较大的经济损失。5.利用RT-PCR技术获得病毒性神经坏死病毒0603株的衣壳蛋白基因,将其插入到杆状病毒Bac-To-Bae表达系统的pFastBacⅠ质粒中,构建了pFastBac-cp质粒,转化DH10Bac大肠杆菌后获得重组穿梭载体Bacmid-cp,脂质体介导转染Sf9细胞产生有感染力的重组杆状病毒AcNPV-cp。SDS-PAGE和Western-blotting分析可见大小约为37kD的特异性蛋白带,其可以与病毒性神经坏死病毒阳性血清反应,表明AcNPV-cp在Sf9细胞中成功地表达了病毒性神经坏死病毒的衣壳蛋白。电镜观察发现,CP蛋白可自行装配成病毒样粒子,其大小形态类似全病毒,并呈晶格状排列在细胞质中。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第1章 文献综述
• 1.1 VNN的发现及危害:
• 1.2 VNN的临床表现:
• 1.3 VNN的病理学变化:
• 1.4 VNN的流行病学
• 1.4.1 易感水生动物
• 1.4.2 传播途径
• 1.5 VNN病原学
• 1.5.1 VNNV的种类和地理分布
• 1.5.2 VNNV的抵抗力
• 1.5.3 VNNV的组织培养特性
• 1.6 VNN的分子生物学
• 1.6.1 VNNV基因组的结构
• 1.6.2 VNNV结构蛋白的结构与功能
• 1.7 检测VNN感染的诊断方法
• 1.7.1 显微镜观察法
• 1.7.2 免疫学方法
• 1.7.3 分子生物学方法
• 1.7.4 细胞培养法
• 1.8 VNN的免疫预防
• 1.9 荧光PCR的概述实时荧光定量PCR技术原理与应用
• 1.9.1 荧光PCR的概述
• 1.9.2 荧光染料的引入途径及工作原理
• 1.9.2.1 SYBR Green Ⅰ的工作原理
• 1.9.2.2 分子信标（molecular beacon）的工作原理
• 1.9.2.3 ZaqMan荧光探针的工作原理
• 1.9.2.4 LUX引物的工作原理
• 1.9.3 实时荧光定量PCR技术的应用
• 1.9.4 存在的问题及应用前景
• 第2章 研究目的和意义
• 第3章 鱼类病毒性神经坏死病的病毒的分离与鉴定
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 病鱼材料
• 3.1.2 细胞
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 引物及酶
• 3.1.5 病毒分离
• 3.1.5.1 病料处理接种
• 3.1.5.2 收集细胞悬液
• 3.1.6 病毒的生物学特性
• 50)测定'>3.1.6.1 病毒滴度(TCID₅₀)测定
• 3.1.6.2 不同细胞的敏感性
• 3.1.7 病毒理化特性础
• 3.1.7.1 热稳定性试验
• 3.1.7.2 pH敏感性试验
• 3.1.7.3 氯仿敏感试验
• 3.1.7.4 IUDR试验
• 3.1.8 RT-PCR
• 3.1.8.1 病毒核酸抽提
• 3.1.8.2 RT-PCR
• 3.1.8.3 PCR产物检测
• 3.1.9 组织病理观察
• 3.2 结果
• 3.2.1 病鱼临床症状
• 3.2.2 病毒分离
• 3.2.2.1 CPE观察
• 3.2.2.2 RT-PCR鉴定结果
• 3.2.3 病毒的生物学特性
• 50试验:'>3.2.3.1 TCID₅₀试验:
• 3.2.3.2 耐热性试验
• 3.2.3.3 氯仿敏感试验
• 3.2.3.4 pH敏感性试验
• 3.2.3.5 IUDR试验结果
• 3.2.4 组织病理观察
• 3.3 讨论
• 第4章 双抗夹心ELISA检测VNNV方法的建立及应用
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 病毒、细胞及试验动物
• 4.1.2 主要培养基和溶液的配制:
• 4.1.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）的相关试剂
• 4.1.4 分泌抗VNNV单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
• 4.1.4.1 病毒的大量培养及纯化
• 4.1.4.2 免疫原的制备
• 4.1.4.3 免疫
• 4.1.4.4 杂交瘤细胞的建立与阳性克隆的筛选
• 4.1.5 单抗的大量制备
• 4.1.6 单抗的纯化:
• 4.1.7 单克隆抗体特异性
• 4.1.8 兔抗VNNV多克隆抗体的制备
• 4.1.8.1 免疫原的制备
• 4.1.8.2 免疫及血清分离
• 4.1.9 检测VNNV ELISA方法的建立
• 4.1.9.1 ELISA方法的建立与检测步骤
• 4.1.9.2 ELISA结果判定标准的确定
• 4.1.9.8 ELISA特异性试验
• 4.1.9.9 临床样品检测
• 4.1.9.10 重复性试验
• 4.1.9.11 保质期试验
• 4.2 结果
• 4.2.1 杂交瘤的稳定性及分泌单抗的间接ELISA效价
• 4.2.2 单克隆抗体的特异性
• 4.2.3 单克隆抗体亚型的鉴定
• 4.2.4 ELISA特异性试验结果
• 4.2.5 批内可重复性试验结果
• 4.2.6 批间重复性试验结果
• 4.2.7 临床样品检测结果
• 4.2.8 保质期试验结果
• 4.3 讨论
• 第5章 鱼类神经坏死病实时荧光RT-PCR检测方法的建立和应用
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 病毒和细胞
• 5.1.2 引物、探针的设计与合成
• 5.1.3 仪器、试剂盒及其它试剂
• 5.1.4 病毒滴度的测定
• 5.1.5 病毒核酸的提取
• 5.1.6 常规RT-PCR
• 5.1.7 荧光RT-PCR检测方法的建立和条件优化
• 5.1.8 荧光RT-PCR的特异性试验
• 5.1.9 荧光RT-PCR与普通RT-PCR灵敏度比较
• 5.1.10 荧光RT-PCR的重复性试验
• 5.1.11 荧光RT-PCR的临床检测
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 荧光RT-PCR反应条件的优化
• 5.2.2 荧光RT-PCR方法的特异性
• 5.2.3 荧光RT-PCR与普通RT-PCR灵敏度比较
• 5.2.4 荧光RT-PCR稳定性和重复性实验
• 5.2.5 荧光RT-PCR方法的临床检测
• 5.3 讨论
• 第6章 6株鱼类病毒性神经坏死病病毒（VNNV）RNA2片段的分子特征和遗传发生分析
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 病毒和细胞
• 6.1.2 主要试剂
• 6.1.3 引物设计与合成
• 6.1.4 病毒RNA的提取
• 6.1.5 RT-PCR扩增
• 6.1.6 扩增产物的克隆和酶切鉴定
• 6.1.7 序列测定和分析
• 6.2 结果
• 6.2.1 RT-PCR扩增结果
• 6.2.2 重组质粒的酶切鉴定
• 6.2.3 RNA2片段的核苷酸序列及推导的氨基酸序列比较
• 6.2.4 VNNV衣壳蛋白RNA2片段限制性内切酶位点分析
• 6.2.5 6株VNNV分离株RNA2片段序列与国内外毒株RNA2序列比较分析
• 6.2.6 VNNV分离株推导的氨基酸序列分析
• 6.3 讨论
• 第7章 鱼类神经坏死病病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及其特性研究
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 病毒、载体和细胞
• 7.1.2 引物
• 7.1.3 细菌及载体
• 7.1.4 酶及化学试剂等
• 7.1.5 主要培养基和溶液的配制
• 7.1.6 穿梭载体Bacmid的提取液
• 7.1.7 SDS-PAGE、Western-blotting的相关试剂
• 7.1.8 病毒RNA的提取
• 7.1.9 VNNV cp基因的RT-PCR扩增
• 7.1.10 VNNV cp基因的克隆
• 7.1.11 重组穿梭载体Bacmid-cp的构建
• 7.1.12 重组杆状病毒（AcNPV-cp）的获得
• 7.1.13 SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达的目的蛋白
• 7.1.14 体外表达CP蛋白的粗纯化
• 7.1.15 电镜观察
• 7.2 结果和分析
• 7.2.1 PCR扩增cp基因:
• 7.2.2 pMD18-cp克隆载体的构建
• 7.2.3 VNNV cp基因的克隆及鉴定
• 7.2.4 穿梭载体Bacmid-cp的构建
• 7.2.5 重组杆状病毒AcNPV-cp的获得
• 7.2.6 体外表达蛋白的鉴定
• 7.2.7 电镜观察
• 7.3 讨论
• 第8章 全文总结
• 参考文献
• CURRICULUM VITAE
• 致谢