迟缓爱德华氏菌两种保护性抗原及AcrAB耐药系统的分析

论文摘要

迟缓爱德华氏菌是危害水产养殖业发展的重要病原菌之一,因而其免疫防治研究具有重要意义。论文分析了9种具有保护潜能的迟缓爱德华氏菌蛋白,经过牙鲆免疫保护实验,筛选出EseD和Et18两种有显著性保护效应的抗原。为了提高其保护效应,论文使用基因工程技术将这两种抗原融合到一起,构建重组融合蛋白EEH。结果表明,融合蛋白EEH保护效应较EseD和Et18分别免疫时有所提高。ELISA和Western blotting结果显示,三种蛋白都能诱导牙鲆产生特异抗体。这些研究为开发迟缓爱德华氏菌疫苗提供了理论基础。论文克隆分析了迟缓爱德华氏菌AcrAB耐药系统,采用定点突变确定了acrAB、acrR的启动子序列和AcrR在acrAB启动子的结合位点。启动子分析显示,AcrR对acrAB启动子有300倍抑制效应,对acrR启动子有3倍抑制效应。定点突变显示,K39和R45对AcrR功能具重要性;缺失突变表明,N端205个氨基酸残基是其功能必需。实验筛选出Acriflavine、Ethidium Bromide、Methyl Viologen、Sodium Dodecyl Sulfate等四种AcrR诱导物。分析AcrR过量表达菌株结果显示,其耐药性、生长状况和毒力水平较阴性对照组降低。这些研究加深了我们对迟缓爱德华氏菌耐药机制及其与毒力关系的了解。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 鱼用疫苗研究
• 1.1.1 鱼类免疫学基础
• 1.1.2 鱼用疫苗的种类
• 1.1.3 抗原基因的筛选
• 1.2 细菌多种药物耐受现象和外排泵研究
• 1.2.1 多种药物耐受现象
• 1.2.2 外排泵
• 1.3 大肠杆菌acrAB 操纵元的研究
• 1.3.1 AcrR 对acrAB 操纵元的负调控
• 1.3.2 整体调控因子对acrAB 操纵元的正调控
• 1.4 迟缓爱德华氏菌的研究
• 1.4.1 迟缓爱德华氏菌疫苗研究
• 1.4.2 迟缓爱德华氏菌分泌系统研究
• 1.4.3 迟缓爱德华氏菌抗原蛋白研究
• 1.4.4 迟缓爱德华氏菌耐药性研究
• 1.5 本研究的目的、意义
• 第二章 迟缓爱德华氏菌保护性抗原蛋白筛选
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 原核表达系统的构建
• 2.1.1.1 基因组DNA 的提取
• 2.1.1.2 蛋白基因的PCR 扩增
• 2.1.1.3 pET 表达载体的构建
• 2.1.2 重组蛋白的表达、纯化
• 2.1.2.1 重组蛋白诱导表达
• 2.1.2.2 SDS-PAGE 分析
• 2.1.2.3 重组蛋白的纯化
• 2.1.3 保护性抗原蛋白筛选
• 2.1.3.1 鱼体的免疫
• 2.1.3.2 攻毒试验
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 基因组DNA 提取结果
• 2.2.2 基因的PCR 扩增结果
• 2.2.3 蛋白诱导表达结果
• 2.2.4 优化的蛋白表达和纯化条件
• 2.2.5 蛋白纯化结果
• 2.2.6 重组蛋白对牙鲆保护效应检测结果
• 2.3 讨论和分析
• 2.3.1 重组蛋白的克隆、表达和纯化
• 2.3.2 鱼类免疫实验的影响因素
• 2.3.3 EseD 和Et18 具有免疫保护效应
• 第三章 EseD 和Et18 融合蛋白的表达和保护效应检测
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 EseD 和Et18 融合蛋白表达载体的构建
• 3.1.1.1 Et18 插入片段的构建
• 3.1.1.2 载体的处理
• 3.1.1.3 构建pETEEH 表达质粒
• 3.1.2 重组融合蛋白EEH 的表达、纯化和保护性检测
• 3.1.3 ELISA 检测
• 3.1.4 Western blotting 检测
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 构建成融合蛋白EEH 表达载体
• 3.2.2 融合蛋白EEH 的表达和纯化
• 3.2.3 融合蛋白EEH 对牙鲆保护效应检测结果
• 3.2.4 ELISA 检测结果
• 3.2.5 Western blotting 结果
• 3.3 讨论和分析
• 3.3.1 融合蛋白EEH 具有较好的免疫保护效应
• 3.3.2 重组蛋白的ELISA 和Western blotting
• 第四章 迟缓爱德华氏菌acrAB 操纵元的克隆
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 迟缓爱德华氏菌染色体步移文库的构建
• 4.1.2 迟缓爱德华氏菌acrAB 操纵元全序列的克隆
• 4.1.2.1 acrA 部分序列的克隆
• 4.1.2.2 acrAB 操纵元全序列的克隆
• 4.1.3 蛋白序列分析
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 迟缓爱德华氏菌acrAB 操纵元序列
• 4.2.2 AcrA、AcrB 和AcrR 序列分析
• 4.3 讨论和分析
• 4.3.1 迟缓爱德华氏菌acrAB 操纵元的构成
• 4.3.2 迟缓爱德华氏菌的AcrA、AcrB 和AcrR 分析
• 第五章 迟缓爱德华氏菌acrAB 操纵元的启动子和AcrR 结合位点分析
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 AcrR 表达载体的构建
• 5.1.2 启动子活性分析
• 5.1.2.1 acrAB 启动子活性分析
• 5.1.2.2 acrR 启动子活性分析
• 5.1.3 acrAB 操纵元启动子的突变分析
• 5.1.3.1 acrAB 启动子突变
• 5.1.3.2 acrR 启动子突变
• 5.1.4 AcrR 在acrAB 操纵元上的结合位点分析
• 5.1.4.1 启动子的定点突变
• 5.1.4.2 AcrR 在acrAB 操纵元上结合位点的定位
• 5.2 实验结果
• 5.2.1 野生型和突变型启动子分析结果
• 5.2.2 启动子的序列特征
• 5.3 讨论和分析
• 5.3.1 acrAB 和acrR 启动子特征
• 5.3.2 大肠杆菌AcrR 对本实验结果的影响分析
• 第六章 AcrR 诱导物筛选和蛋白结构分析
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 药物对AcrR 的诱导效应分析
• 6.1.2 诱导物对acrAB 操纵元基因表达的影响
• 6.1.3 AcrR 缺失突变和定点突变分析
• 6.1.3.1 AcrR C 端缺失突变
• 6.1.3.2 AcrR 定点突变
• 6.1.3.3 突变效应分析
• 6.2 实验结果
• 6.2.1 诱导物筛选结果
• 6.2.2 Acriflavine 和Methyl Viologen 对acrA 和acrR 表达的影响
• 6.2.3 AcrR 缺失突变和定点突变对其活性的影响
• 6.3 讨论和分析
• 6.3.1 迟缓爱德华氏菌AcrR 的诱导物
• 6.3.2 迟缓爱德华氏菌AcrR 的结构分析
• 第七章 acrR 过量表达分析
• 7.1 材料和方法
• 7.1.1 acrR 过量表达迟缓爱德华氏菌株的构建
• 7.1.1.1 质粒的构建
• 7.1.1.2 菌株的构建
• 7.1.2 耐药性分析
• 7.1.3 生长状况分析
• 7.1.4 毒力分析
• 7.2 实验结果
• 7.2.1 耐药性分析结果
• 7.2.2 生长状况分析结果
• 7.2.3 毒力分析结果
• 7.3 讨论和分析
• 结论
• 参考文献
• 博士期间发表的论文
• 致谢