给水生物预处理系统中微生物的群落结构分析

论文摘要

微污染原水中的溶解性有机物与氨氮问题难以用传统的净水工艺解决,在常规净水工艺之前增设生物预处理工艺,对给水水质的改善有十分重要的作用。在生物预处理系统中,生物膜内的原核微生物是微污染原水中碳元素和其他营养物质去除的主要承担者。原水中氨氮和亚硝氮的去除由化能自养的氨氧化细菌（AOB）和亚硝酸盐氧化细菌相继完成,其中由AOB完成的将氨转化为亚硝酸盐的过程是硝化反应的限速步骤。给水生物预处理反应器提供了特殊的贫营养生物膜环境,对反应器中微生物群落及生态功能的全面认识有助于了解影响污染物降解效率和稳定性的因素,并将为环境微生物生态学研究提供有意义的信息。本论文综合使用多种分子生物学手段,包括核酸提取、分子克隆文库构建、16S rDNA序列同源性分析、反转录PCR、变性梯度凝胶电泳（DGGE）和实时荧光定量PCR技术等,分析用于给水预处理的生物接触氧化反应器系统中的微生物群落组成,并重点对反应器内的氨氧化细菌群落进行研究,结合相关参数,探讨氨氧化细菌种群动态变化、环境因子变化以及反应器氨氮去除效率间的相互关系,探索以分子手段对反应器运行进行动态实时监测的可行性。对细菌16S rDNA片段克隆文库的克隆子序列同源性分析结果表明,生物接触氧化反应器中细菌群落多样性丰富,至少包含了细菌域的13个细菌类群,其中属于α-、β-、γ-变形菌纲的克隆子是克隆文库中的优势细菌类群。反应器内富集了各种贫营养细菌,属于α-变形菌纲的紫色非硫细菌Rhodobacter可能是反应器中进行有机物分解的重要细菌种群,Nitrospira属细菌是反应器中亚硝酸盐氧化反应的承担者。经由纯培养方法得到的细菌群落结构与克隆文库方法相比存在很大的差异。对上海惠南水厂和航头水厂生物接触氧化反应器中生物膜样品的AOB群落通过不同的目标片段（16S rRNA片段和编码氨单加氧酶活性部位的amoA片段）结合不同的实验技术路线进行分析。结果表明在进行氨氧化细菌生态学研究时选择合适的目标片段、引物对、以及合理的分析手段和实验流程的重要性。给水生物接触氧化反应器中的AOB至少由3种种群组成:属于Nitrosomonas oligotropha lineage的AOB种群、属于Nitrosomonas communis lineage并与其中的Nitrosomonas nitrosa同源性较高的AOB种群、以及一种尚未得到纯培养物的未知AOB种群。结合DNA来源和RNA来源的AOB 16S rRNA和amoA片段扩增产物进行的DGGE分析结果表明在两个水厂的生物接触氧化反应器中的AOB显示了相同的种群结构和季节变迁特征,说明AOB种群在给水生物预处理反应器中遵循特定的环境变化适应机制。对基于RNA的扩增片段进行DGGE指纹图谱分析能够更敏感地反映生物膜样品中AOB的种群结构变化。研究结果还表明同源于N. nitrosa的AOB对环境温度的改变较敏感,在温度较高时显示了较高的生理活性和功能活性。运用实时荧光定量PCR技术对生物膜样品中总细菌和总氨氧化细菌的16S rDNA片段进行定量分析,结果表明在生物接触氧化反应器内总细菌和总AOB的细胞数量在一年内的波动高达4个数量级。总AOB细胞数占总细菌数的0.23%至1.8%。统计学分析表明生物膜内细胞数量的这种波动与原水的温度变化相关,且生物膜内总氨氧化细菌的细胞数量与反应器的氨氮去除效率呈正相关。对生物接触氧化反应器内3种AOB种群的amoA基因片段进行实时荧光定量PCR分析,结果表明,一年内生物膜中的AOB种群结构变化很大,类N. oligotropha和类N. nitrosa氨氧化细菌在一年中交替成为反应器的优势AOB种群。统计学分析表明同源于N. nitrosa的AOB种群和未知AOB种群的细胞数量变化与反应器的氨氮去除效率波动呈正相关,且后者更加显著相关,表明未知AOB种群很可能就是反应器内影响氨氮去除效率的关键种群。且该种群细胞数量变化与温度变化不相关,在12月至1月的低水温环境中该种群具有较高的竞争优势,这一研究结果对给水生物预处理反应器在低温环境的运行优化有重要的意义。本文还证明了实时荧光定量PCR是一种快速有效的分子监测手段,在反应器的运行过程中,加强对细菌群落和关键氨氧化细菌种群的监测,将帮助预测反应器运行效果,并有根据地对反应器进行干预和调控。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 给水生物预处理工艺概述
• 1.1.1 原水水质现状
• 1.1.2 微污染原水中污染物的危害及传统处理工艺的局限性
• 1.1.3 给水生物预处理工艺的引进及其特点
• 1.1.4 给水生物接触氧化工艺概述
• 1.2 给水生物预处理工艺中的硝化过程
• 1.3 给水生物预处理工艺中的生物相
• 1.3.1 贫营养环境及其中的微生物
• 1.3.2 给水生物预处理反应器中生物相的研究意义
• 1.3.3 传统方法对生物膜中生物相的认识
• 1.3.4 传统方法研究生物膜中生物相的局限
• 1.4 分子生物学研究手段在环境微生物学领域的应用
• 1.4.1 基因序列系统发育分析方法
• 1.4.2 基因指纹图谱技术
• 1.4.3 以rRNA 为靶序列的探针杂交技术
• 1.4.4 定量PCR 分析方法
• 1.4.5 基因芯片技术
• 1.5 本课题的研究意义和研究内容
• 1.5.1 本课题的研究意义
• 1.5.2 研究内容和拟达到的目标
• 参考文献
• 2 给水生物接触氧化反应器中总细菌群落的多样性研究
• 2.1 前言
• 2.1.1 用于给水生物预处理反应器的传统微生物鉴定方法
• 2.1.2 16S rDNA 序列同源性分析方法及其应用
• 2.1.3 本章研究意义和主要内容
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 生物膜样品采集
• 2.2.2 生物膜样品中的异养细菌纯培养
• 2.2.3 生物膜样品基因组DNA 的提取与纯化
• 2.2.4 生物膜样品中真细菌16S rDNA基因片段扩增
• 2.2.5 16S rDNA 基因片段的克隆文库构建
• 2.2.6 重组质粒的筛选和提取
• 2.2.7 基因测序及系统发育分析
• 2.2.8 克隆文库多样性的统计学分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 异养细菌纯培养与菌种鉴定结果
• 2.3.2 生物膜样品基因组DNA 提取结果
• 2.3.3 生物膜样品细菌16S rDNA 基因片段扩增及克隆文库的构建与鉴定
• 2.3.4 细菌16S rDNA克隆文库多样性分析
• 2.3.5 细菌16S rDNA 文库克隆子的系统发育分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 纯培养方法和克隆文库方法揭示的总细菌群落多样性
• 2.4.2 生物膜样品细菌16S rDNA克隆文库多样性的统计学分析
• 2.4.3 冬季与夏季生物膜样品的细菌群落结构差异
• 2.4.4 给水生物接触氧化反应器中的贫营养细菌
• 2.4.5 给水生物接触氧化反应器中的功能细菌
• 参考文献
• 3 给水生物接触氧化反应器中氨氧化细菌的分子多样性研究
• 3.1 前言
• 3.1.1 氨氧化细菌的生理生化机制概述
• 3.1.2 氨氧化细菌的系统发育研究
• 3.1.3 氨氧化细菌的分子研究特征基因
• 3.1.4 环境中氨氧化细菌的生态分布
• 3.1.5 本章研究意义和主要内容
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 生物膜样品
• 3.2.2 氨氧化细菌CTO 片段的PCR 扩增
• 3.2.3 氨氧化细菌CTO 片段的克隆与克隆子归类
• 3.2.4 氨单加氧酶基因（amoA）片段的PCR 扩增
• 3.2.5 氨氧化细菌amoA 基因片段的克隆与克隆子归类
• 3.2.6 基因测序及系统发育分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 氨氧化细菌CTO片段和amoA基因片段的PCR扩增
• 3.3.2 氨氧化细菌CTO 片段的克隆与序列分析
• 3.3.3 氨氧化细菌amoA基因片段的克隆与序列分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 基于CTO 片段和amoA 基因片段的AOB 多样性研究结果的比较
• 3.4.2 生物膜中AOB 的种群多样性和生态分布讨论
• 3.4.3 生物预处理反应器中氨氧化细菌群落的功能冗余
• 参考文献
• 4 给水生物接触氧化反应器中氨氧化细菌的种群变迁研究
• 4.1 前言
• 4.1.1 变性梯度凝胶电泳技术原理
• 4.1.2 DGGE 技术在氨氧化细菌生态学研究中的应用
• 4.1.3 基于RNA的分子生物学技术手段及其应用
• 4.1.4 本章研究意义和主要内容
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 生物膜样品采集
• 4.2.2 生物膜样品的总核酸提取与纯化
• 4.2.3 氨氧化细菌165 rRNA 特异性片段和amoA mRNA 片段反转录
• 4.2.4 基于CTO片段的PCR扩增和V3区巢式扩增
• 4.2.5 V3 区巢式扩增产物变性梯度凝胶电泳分析
• 4.2.6 氨氧化细菌16S rDNA 和165 rRNA 特异性长片段的克隆与克隆子归类
• 4.2.7 基于amoA 基因片段的PCR 扩增和变性梯度凝胶电泳分析
• 4.2.8 基因测序及系统发育分析
• 4.2.9 DGGE凝胶图谱分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 上海航头水厂生物接触氧化反应器水样理化指标分析
• 4.3.2 生物膜样品总核酸提取结果
• 4.3.3 氨氧化细菌CTO 片段的V3 区巢式扩增结果
• 4.3.4 生物膜样品中氨氧化细菌V3 区巢式扩增产物的DGGE 垂直胶和水平胶实验
• 4.3.5 氨氧化细菌16S rDNA 和165 rRNA 特异性长片段克隆文库结合V3 区的DGGE 指纹图分析
• 4.3.6 基于amoA 片段的PCR 扩增和DGGE 指纹图分析
• 4.3.7 航头水厂和惠南水厂氨氧化细菌扩增片段的DGGE 指纹图比较
• 4.4 讨论
• 4.4.1 不同靶基因片段和不同技术路线的实验方法比较
• 4.4.2 给水生物接触氧化反应器中氨氧化细菌的种群变迁
• 4.4.3 给水生物接触氧化反应器中新氨氧化细菌种群序列的发现
• 参考文献
• 5 Real-time PCR 定量给水生物接触氧化反应器中的氨氧化细菌种群
• 5.1 前言
• 5.1.1 环境样品中氨氧化细菌的定量方法
• 5.1.2 实时荧光定量PCR的技术原理
• 5.1.3 实时荧光定量PCR 技术的实验条件和影响因素
• 5.1.4 实时荧光定量PCR技术研究环境样品中的氨氧化细菌
• 5.1.5 本章研究意义和主要内容
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 生物膜样品
• 5.2.2 引物和探针的选择和设计
• 5.2.3 qRT-PCR 标准品准备
• 2+浓度摸索'>5.2.4 最佳引物、探针和Mg²⁺浓度摸索
• 5.2.5 qRT-PCR 检测生物膜中总细菌和氨氧化细菌数量
• 5.2.6 统计学分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 标准曲线的建立
• 5.3.2 生物膜样品中的总细菌和氨氧化细菌定量结果
• 5.4 讨论
• 5.4.1 生物膜样品中氨氧化细菌群落的丰度和动态变化
• 5.4.2 环境因子对氨氧化细菌种群结构动态变化的影响
• 5.4.3 氨氧化细菌种群结构动态变化与氨氮去除效果的相关性
• 5.4.4 给水生物预处理反应器中氨氧化细菌种群细胞数量的分子监测
• 参考文献
• 6 结论与展望
• 论文的创新性
• 附录 1 缩写词列表
• 致谢
• 攻读博士学位期间已发表的学术论文目录