论文摘要
肿瘤细胞对抗癌药物产生多药耐药性（multidrug resistance，MDR）是肿瘤化疗失败的主要原因，也是化学疗法介入肿瘤治疗以来一直悬而未决的重要问题。探寻可逆转或降低肿瘤耐药性的各种途径，以提高现有抗癌药物的疗效，是当前肿瘤领域的重要课题之一。本文的目的是研制具有逆转肿瘤细胞耐药性作用的聚合物胶束给药体系，探讨其逆转肿瘤多药耐药性的机理，从制剂角度通过载体系统来寻求逆转肿瘤多药耐药性的新途径，并建立探寻逆转肿瘤耐药新途径、评价逆转作用的技术平台。 本研究主要内容包括：耐药肿瘤细胞模型的建立；具有逆转肿瘤细胞耐药性潜力的聚合物载体的筛选；以抗肿瘤药紫杉醇（Paclitaxel，PTX）和9-硝基喜树碱（9-nitrocamptothecin，9-NC）为模型药，聚合物胶束给药体系的研制；以耐药肿瘤细胞为平台，聚合物胶束给药体系逆转肿瘤细胞耐药作用的考察及机理的探讨；胶束给药体系体内药物动力学及组织分布的研究。 本课题采用P-糖蛋白（P-gp）高表达的Caco-2细胞及人卵巢癌紫杉醇耐药细胞（Skov-3／PTX）作为耐药肿瘤细胞模型。以PTX为诱导剂，采用浓度梯度递增法历时11个月建立了50ng／mL PTX中稳定生长增殖的Skov-3／PTX耐药细胞株，并对Caco-2细胞及Skov-3／PTX细胞的生物学性状进行了检测和鉴定。培养14天后的Caco-2细胞P-gp活性较高，对Rh-123和紫杉醇均会产生耐药性，P-gp底物环孢菌素（CsA）可以部分逆转该耐药性。Skov-3／PTX细胞对紫杉醇耐药指数达45.90，对吉非替尼、9-硝基喜树碱和阿霉素产生明显交叉耐药性。RT-PCR研究表明该耐药株的MDR1、MRP和GST-p mRNA水平高于亲本细胞。Rh-123和紫杉醇的细胞摄取实验均进一步证明Skov-3／PTX细胞对Rh-123和紫杉醇均会产生显著耐药性，P-gp底物CsA可以部分逆转该耐药性，增加Rh-123和紫杉醇在细胞中的摄取量。 紫杉醇理化性质研究表明，紫杉醇在水中难溶，溶解度仅约0.48μg／mL，pH变化（pH4～8）对其溶解度无显著影响。其在正辛醇中易溶，脂溶性强。故紫杉醇适宜作为两亲性共聚物胶束的模型药物。随后我们以Caco-2、Skov-3／PTX为细胞模型考察了Pluronic系列中的L61、P123、P105和F127对耐药细胞摄取药物量的影响，进行胶束载体材料的筛选，为制备可逆转肿瘤耐药性的胶束给药体系提供实验基础。筛选结果显示，载体浓度高于临界胶束浓度时，PluronicP123、L61和P105可以增加PTX在耐药细胞Caco-2、Skov-3／PTX中的药物摄取量，但P123和L61作用更为显著。而F127则对耐药细胞摄取PTX无促进作用。故选择Pluronic P123和L61作为共聚物胶束载体进行制剂研究。由于Pluronic L61的亲水嵌段过短，室温下在水中难溶，难以制成载药胶束制剂。故采用Pluronic P123作为载体，进行紫杉醇共聚物胶束的研制。采用薄膜水化法制备PTX的Pluronic P123共聚物胶束。以包封率、载药量和胶束溶液药物浓度为指标，在单因素试验初选的基础上，采用星点设计-效应面优化法对胶束处方进行优化。最终确定较优处方为：PTX 2mg，水相量为5mL（载体量100mg）。为进一步增加胶束贮存的稳定性，我们将胶束进行冷冻干燥，并对冷冻干燥的工艺作了初步考察优化，采用5％海藻糖作为冻干保护剂。胶束理化性质考察结果显示，胶束呈圆球状，大小比较均匀，粒径约为25.2nm，胶束中PTX的体外释放呈现缓释效果，且胶束给药体系在人血浆中结构较稳定。 Pluronic P123胶束可以增加PTX及Rh-123在Caco-2及Skov-3／PTX细胞中的摄取量，作用具有载体浓度依赖性；可以提高耐药细胞对抗肿瘤药物的敏感性其在Caco-2、Skov-3／PTX细胞中相对于PTX的耐药逆转指数分别为5.04和13.77，故Pluronic P123胶束具有逆转肿瘤细胞耐药性的作用。在逆转机理研究中，考察了胶束对细胞膜流动性、细胞MDR1、MRP和GST mRNA水平及ATP水平的影响。研究结果显示，Pluronic P123以胶束形式存在时可以增加细胞膜流动性，且该作用具有浓度依赖性；可以抑制耐药细胞的MDR1、MRP和GST-pmRNA水平；可以耗竭耐药细胞的ATP水平。 通过对Pluronic P123胶束制剂和Taxol注射液静脉注射后大鼠体内药动学和小鼠体内组织分布的研究，进一步考察Pluronic P123胶束制剂的体内释药特性。研究结果显示，Pluronic P123胶束制剂可以改变紫杉醇的体内药动学和组织分布参数。其可显著延长紫杉醇在大鼠和小鼠体内的血循环时间，增加其在血浆、肾、卵巢&子宫、肺中的分布量，并减少在肝脏中的药物蓄积。胶束制剂和对照制剂Taxol在大鼠体内的紫杉醇t1／2β分别为5.85±1.52h和2.50±0.63h（P＜0.05）；大鼠体内的血浆AUC分别为：2916.8±873.6μg·L-1·h和1007.9±192.6μg·L-1·h；在小鼠体内的血浆AUC分别为：3.35μg·h·g-1和1.82μg·h·g-1。 9-NC为难溶性药物，水中溶解度约5μg／mL，pH变化（pH1～7）对其溶解度无显著影响。9-NC在正辛醇／水中的表观分配系数先随pH升高而增加，在pH5.0时油水分配系数最高，LogP为2.08，之后又随pH升高而降低，即在pH5.0时脂溶性相对较强。采用两因素、五水平的星点设计-效应面优化法进行9-NC-Pluronic P123胶束处方优化，获得较优处方为：9-NC 1mg，水相量为15mL（载体量100mg）。胶束理化性质表征结果显示，胶束呈圆球状，大小比较均匀，粒径约为23.2nm，胶束中9-NC的体外释放呈现缓释效果，且胶束给药体系在人血浆中结构较稳定。 9-NC胶束在Skov-3／PTX细胞中的药物摄取及体外细胞毒研究表明，PluronicP123可以逆转Skov-3／PTX细胞对9-NC的交叉耐药性，增加耐药细胞中的药物摄取量，提高药物对耐药肿瘤细胞的毒性（耐药逆转指数为3.57）。大鼠体内药物动力学研究结果显示，胶束制剂可以显著延长9-NC的体内循环时间，给予相同剂量9-NC胶束及对照溶液后，胶束血浆中药物浓度显著高于溶液剂（P＜0.05），试验制剂的AUC0～t、AUC0～8分别是对照制剂的3.6和3.7倍。小鼠体内组织分布研究结果显示，与溶液剂相比，胶束可显著增加9-NC在肺、卵巢／子宫、肾和胰中的蓄积量。血浆和脾中的药物蓄积量也得到不同程度的增加。但对心脏中的药物分布没有显著性的影响，而肝脏中的药物蓄积量显著降低。
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