猪脑心肌炎病毒VP1基因的原核表达、血清学调查及分离毒株的鉴定

论文题目: 猪脑心肌炎病毒VP1基因的原核表达、血清学调查及分离毒株的鉴定

论文类型: 博士论文

论文专业: 预防兽医学

作者: 盖新娜

导师: 杨汉春

关键词: 猪脑心肌炎病毒,结构蛋白,原核表达,血清学调查,病毒分离与鉴定

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 猪脑心肌炎是由脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus, EMCV）引起猪的以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要临床特征的急性传染病。本研究成功地克隆并表达了EMCV结构蛋白VP1基因,利用表达的重组VP1蛋白建立了检测EMCV抗体的间接ELISA,并对我国部分地区猪场EMCV感染进行了血清学调查;从临床组织样本中分离到5株猪脑心肌炎病毒,对分离毒株的VP1基因和部分3D基因进行了序列分析。 采用RT-PCR技术扩增出猪EMCV的完整VP1基因,将目的片段克隆到原核表达载体pGEX-6P-1,经0.1 mmol/L IPTG诱导后,重组蛋白GST-VP1的表达量可达27.1%,SDS-PAGE分析表明,表达产物的分子量为60.0 kDa。Western-Blotting分析表明,重组蛋白可被EMCV阳性血清所识别。 以纯化的重组蛋白GST-VP1为抗原,建立了检测EMCV抗体的间接ELISA,并确定了间接ELISA的最佳工作条件。结果表明,重组蛋白抗原的最适包被浓度为0.625 μg/mL;待检血清的最适稀释度为1:50;HRP-兔抗猪lgG的最适工作浓度为1:800;待检血清和酶标二抗的反应条件为37℃ 45min;血清样本的阴阳性临界值为0.3。与间接免疫荧光试验比较,结果表明该方法具有良好的特异性和敏感性。用建立的间接ELISA对我国13个地区规模化养猪场的1786份血清样本进行了检测,结果表明,EMCV抗体平均阳性率为75.84%。表明我国猪场已普遍存在EMCV感染。 利用BHK-21细胞,从北京、河北、天津、湖北和辽宁等地临床组织样本中分离到5株猪脑心肌炎病毒,分别命名为EMCVBJC3、EMCVHB1、EMCVHuB1、EMCVLN1和EMCVTJ1。对分离毒株进行了间接免疫荧光鉴定。免疫电镜观察结果表明,分离毒株的病毒粒子直径约27nm。理化特性鉴定结果表明,EMCV BJC3和HB1均不耐酸,对氯仿不敏感,但对胰蛋白酶有不同的敏感性,60℃加热1h可将病毒杀死,50℃热环境下Mg2+对病毒几乎无保护作用。 对分离毒株的VP1基因和部分3D基因的序列测定和分析结果表明,5株EMCV VP1基因的核苷酸序列同源性在99%以上,其推导的氨基酸序列的同源性为97.5%以上;与GenBank中参考毒株VP1基因的核苷酸序列同源性介于81.61%～99.69%之间,氨基酸序列同源性为95.5%以上。分离毒株3D基因扩增片段的核苷酸序列和氨基酸序列与参考毒株的同源性均为100%。基于VP1基因的系统进化分析表明,5个分离毒株均位于系统进化树的主干上,其变异度不大。

论文目录:

摘要

Abstract

插图和附表清单

缩略词表

第一章 引言

1.1 国内外研究概况

1.2 研究内容和技术路线

1.3 研究目的与意义

1.4 研究目标

第二章 猪脑心肌炎病毒结构蛋白VP1基因的克隆与原核表达

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 猪脑心肌炎病毒抗体检测间接ELISA的建立及血清学调查

3.1 引言

3.2 材料和方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 猪脑心肌炎病毒的分离与鉴定

4.1 引言

4.2 材料和方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

4.5 小结

第五章 结论

第六章 创新点

第七章 文献综述 猪脑心肌炎病毒研究进展

7.1 病原学

7.2 流行病学

7.3 致病机理

7.4 诊断技术

7.5 疾病防治

7.6 公共卫生学

参考文献

致谢

作者简介

发布时间: 2005-07-18

参考文献

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