RNA干扰NPM基因表达对白血病细胞生物学特性的影响

论文摘要

白血病是造血干细胞克隆性疾病,是一组高度异质性的恶性血液病。靶向白血病细胞的化疗是当前治疗的主要手段,但仍无法解决白血病的复发、转移及耐药等诸多问题。目前分子水平的靶向治疗成为研究的热点问题。核仁磷酸蛋白（nucleophosmin1, NPM）是主要位于核仁颗粒区的一种多功能蛋白。NPM直接参与核糖体的合成、中心体的复制等细胞增殖过程中的关键分子事件;同时NPM通过干扰素调节因子发挥凋亡调节作用。NPM基因异常可导致细胞恶性增殖和抵抗凋亡,与肿瘤的发生密切相关。已知多种实体肿瘤细胞高表达NPM,NPM可作为诊断肝细胞癌等恶性肿瘤的分子标志物。有文献报道白血病细胞中不同程度地高表达NPM,但NPM参与白血病发生的分子机制尚未阐明。RNA干扰技术是一种新的基因治疗技术,能有效、特异地抑制细胞内基因的表达,利用RNAi抑制某些功能基因或融合基因的表达,从而抑制细胞增殖,诱导其凋亡,增强白血病细胞对化疗药物的敏感性,已成为白血病基因治疗的一条新途径。本课题采用RNA干扰技术,以NPM高表达的白血病K562细胞系为研究对象,分析抑制NPM表达对白血病细胞增殖和凋亡的影响。主要结果和结论如下:1.检测白血病细胞NPM mRNA和蛋白表达。采用RT-PCR、FQ-PCR以及免疫组化检测K562细胞NPM基因和蛋白的表达,发现白血病细胞高表达NPM mRNA,模板拷贝数较正常血细胞高7.3倍,同时白血病细胞高表达NPM蛋白,提示白血病细胞高表达NPM基因。2.构建靶向NPM基因的RNAi重组体,转染K562细胞后观察shRNA对靶基因的抑制作用。实验成功构建靶向NPM基因的pGenesil-1/NPM重组体,运用脂质体转染方法将重组体导入K562细胞后,FQ-PCR检测发现转染细胞NPM mRNA拷贝数下降70%,免疫组化结果揭示转染细胞NPM蛋白水平的明显下调,证明pGenesil-1/NPM能够高效沉默K562细胞NPM基因的表达。3.观察抑制NPM基因对K562细胞生物学特性的影响。运用MTT、半固体培养技术、流式细胞术检测RNAi重组体转染对K562细胞增殖的影响。结果表明,沉默NPM基因可抑制K562细胞增殖,使细胞大多停留在G1期。利用分光光度法检测caspase-3和caspase-8活性,发现抑制NPM基因表达可增强两种蛋白酶活性,提示抑制NPM基因可通过调控死亡受体caspase途径而促进白血病细胞凋亡。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 白血病细胞NPM 基因表达水平的检测论文
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第二部分 shRNA 抑制白血病细胞NPM 基因表达
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第三部分 抑制NPM 基因表达对白血病细胞生物学特性的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 全文总结
• 文献综述一
• 文献综述二
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文