水稻对铝毒敏感突变体的筛选、基因鉴定及应答机制研究

论文摘要

利用1635份以粳稻日本晴（Oryza sativa L.subsp.Japonica,cv.Nipponbare）为受体构建的增强子捕获突变系,筛选获得了一个对铝毒敏感的T-DNA插入突变体。对突变体进行了遗传分析和共分离分析,克隆了T-DNA插入的旁邻序列;同时利用突变体研究了水稻对铝毒敏感的机理;为水稻铝毒敏感基因的克隆和机理研究奠定基础。主要结果如下:（1）一个水稻铝毒敏感T-DNA插入突变体的筛选和初步分析通过筛选1635份水稻增强子捕获突变系得到一个水稻对铝毒敏感的T-DNA插入突变体——T9610。在50μM Al3+（pH 4.5）浓度下,野生型亲本日本晴的根伸长量被抑制了10%,而突变体根伸长量被抑制52%。遗传分析和共分离分析表明该突变体符合单基因遗传模式,突变体及其后代分离群体做潮霉素抗性检测及PCR分子检测,证实该突变体是由T-DNA插入所引起的,突变表型与T-DNA共分离,southern分析可知突变体为单拷贝插入;用PCR-Walking技术克隆了T-DNA插入的旁邻序列,推测的基因编码一个假定胁迫蛋白,属于TPR蛋白家族。氨基酸序列分析该蛋白与其他作物的TPR蛋白有很高的同源性。生物信息学分析,突变体中T-DNA插入到该基因的第四个外显子中,由于T-DNA插入导致此基因的失活,所以突变体比野生型对铝毒要敏感。（2）铝敏感水稻突变体在铝胁迫下抗氧化系统的应答机制利用铝毒敏感突变体（T9610）和野生型（Nipponbare）研究幼苗期对铝胁迫抗氧化系统的应答机制,表明野生型和突变体经Al3+胁迫后都有ROS的产生和积累。随着Al3+浓度的增加,突变体和野生型的MDA含量都增加;在500μM Al3+的处理下,铝敏感水稻突变体叶片膜脂过氧化程度最深。高浓度Al3+胁迫后,特别是Al3+浓度达到200μM以后,突变体的抗氧化酶类,如SOD,CAT受抑制下降明显,从而导致H2O2累积,诱导过氧化物酶的产生,敏感突变体中的POD活性显著高于野生型。因此Al3+胁迫下,突变体的抗氧化酶类,特别是CAT活性显著降低,而POD活性升高可能是其对Al3+胁迫更加敏感的生理原因之一。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 第一章 文献综述
• 第一节 铝毒研究概述
• 1.铝毒和铝对植物的毒害
• 1.1 铝毒
• 1.2 铝对植物的毒害
• 2.植物的耐铝机制
• 2.1 有机酸与植物的耐铝性
• 2.2 铝胁迫相关酶（蛋白质）与植物的耐铝性
• 2.3 氧化胁迫作用与植物耐铝性
• 第二节 水稻中的T-DNA标签研究概述
• 1.水稻功能基因组学
• 2.T-DNA标签技术及其在水稻功能基因组研究中的应用
• 2.1 T-DNA转移和整合的机理
• 2.2 T-DNA插入标签研究基因功能的策略
• 2.3 T-DNA插入突变体侧翼序列的扩增及分析
• 2.4 T-DNA标签在水稻中的应用
• 第三节 水稻耐铝毒的分子生物学研究概述
• 第四节 本研究的目的和意义
• 第二章 一个水稻铝毒敏感T-DNA插入突变体的筛选和初步分析
• 摘要
• 1.前言
• 2.材料和设备
• 2.1 试验材料
• 2.2 主要试剂
• 2.3 主要设备
• 3.实验方法
• 3.1 突变体的筛选
• 3.2 突变体的遗传分析
• 3.3 共分离的PCR验证
• 3.4 Southern杂交
• 3.5 旁邻序列的扩增
• 3.6 T-DNA插入位点及其被插入基因的结构分析和蛋白结构分析
• 4.结果与分析
• 4.1 突变体的筛选和表型
• 4.2 突变体的遗传分析与共分离分析
• 4.3 T9610中T-DNA插入位点数目的Southern blot检测
• 4.4 T-DNA插入位点及其被插入基因的结构分析
• 5.讨论
• 6.进一步研究设想
• 第三章 铝敏感水稻突变体在铝胁迫下抗氧化系统的应答机制
• 摘要
• 1.前言
• 2.材料与方法
• 2.1 植物材料和萌发条件
• 2.2 膜脂过氧化的分析
• 2.3 POD、CAT、SOD的提取和测定
• 2.3.1 SOD活性测定
• 2.3.2 CAT活性的测定
• 2.3.3 POD活性的测定
• 2.4 蛋白含量的测定
• 2.5 数据处理
• 3.结果与分析
• 3.1 铝胁迫对铝敏毒感突变体脂质过氧化的影响
• 3.2 铝胁迫下铝毒敏感突变体SOD应答
• 3.3 铝胁迫下铝毒敏感突变体CAT应答
• 3.4 铝胁迫下铝毒敏感突变体POD应答
• 4.讨论
• 第四章 全文结论
• 参考文献
• 附录1 基本实验方法
• 附录2 主要试剂及培养基的配方
• 致谢