金属硫蛋白拮抗细菌脂多糖急性肝损伤的机制研究

论文摘要

细菌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是一类由革兰氏阴性杆菌产生的内毒素。在感染等情况下，大量LPS进入机体可引发全身多器官炎症反应。低剂量的LPS同样也可以导致机体的损伤。由于肝脏是清除内毒素的主要场所，肝脏成为内毒素引起的全身炎症反应中最易受损的器官之一。因此，研究LPS引起的炎症反应与肝脏损伤的关系具有十分重要的现实意义。金属硫蛋白（Metallothionein，MT）是一类广泛存在于生物体内富含半胱氨酸、低分子量的、可被金属诱导产生的金属结合蛋白。MT在重金属解毒，维护机体内稳态，增强机体适应能力等方面发挥着重要的生物学作用，是一种可以抵抗外源性损伤的细胞防御性蛋白。Tomoki等发现MT基因敲除小鼠对LPS引起的炎症反应较与之对应的野生型小鼠更为敏感，提示MT在LPS引起的炎症损伤中发挥一定的保护作用，但其具体机制目前尚不清楚。本研究通过观察MT（MT-Ⅰ、MT-Ⅱ）基因敲除（MT-／-）小鼠、与相对应的野生型（MT+／+）小鼠以及以硫酸锌（ZnSO4）诱导形成的MT高表达小鼠三种动物模型对LPS引起的急性肝脏损伤程度的比较。进而以肝脏KC细胞特异性抑制剂氯化钆（Gadolinium Chloride，GdCl3）抑制KC活性，应用NF-κB特异性抑制剂四氢化吡咯二硫代氨基甲酸脂（Pyrollidine Dithiocarbamate，PDTC）抑制NF-κB的转录活性，探讨KC细胞、NF-κB信号通路在LPS致肝脏急性炎症过程中的作用及MT的调控作用。初步探讨金属硫蛋白在LPS引发急性肝脏损伤中的作用及其可能机制。本课题包括以下两个部分：第一部分：MT对LPS致急性肝脏炎性损伤的影响使用MT基因敲除（MT-／-）小鼠、野生型（MT+／+）小鼠为动物模型，采用镉饱和法测定MT含量，确证动物模型可靠性。腹腔注射不同剂量LPS（1mg／kg、5mg／kg、10mg／kg、20mg／kg）24小时后处死动物，以10mg／kg剂量腹腔注射LPS分别在3h、6h、12h、24h、48h后处死动物，每组6只动物。通过组织病理学、血液生化分析比较观察不同MT表达水平动物模型对LPS致急性肝脏炎症损伤的敏感性差异。采用ELISA法测定细胞因子含量，GRIESS法检测NO含量，观察不同MT表达水平动物模型中上述具有细胞毒性效应炎性介质表达的差异。通过脂质过氧化产物、蛋白质过氧化产物的测定，从自由基损伤角度初步观察MT对LPS致肝脏炎症损伤保护效应的可能机制。结果表明，LPS可以使两种小鼠ALT、AST等血清酶活性均呈时间、剂量依赖性升高。组织病理学检查显示，肝脏出现肝细胞浊肿，空泡变性、灶性液化坏死、星状细胞增生。细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达上调，血清以及肝脏组织内NO含量增加。肝脏内脂质过氧化产物增加。MT+／+小鼠血清ALT，AST等升高趋势较MT-／-小鼠更为显著。炎症反应早期MT-／-小鼠肝组织内炎性细胞浸润程度轻于MT+／+小鼠，随炎症反应时间延长，MT-／-小鼠较MT+／+小鼠肝组织损伤程度呈加重趋势。LPS作用下，MT-／-小鼠较MT+／+小鼠细胞因子、NO等细胞毒性炎性介质表达上调趋势更为显著。LPS致MT-／-小鼠肝脏脂质过氧化程度较MT+／+小鼠更为严重。结论MT对LPS引起的肝脏损伤具有保护作用，其可能机制与MT对LPS以及对LPS致炎过程中生成的ROS的清除作用以及MT表达水平导致机体对外源性LPS刺激清除作用不同有关。以Zn（ZnSO4 300μmol／kg s．c．连续给药两天）作为诱导剂形成MT的高表达小鼠为动物模型，通过镉饱和法测定肝组织内MT含量，通过血液生化活性分析。肝脏组织病理学检查、细胞因子、NO测定、脂质过氧化产物检测，比较观察MT表达增高是否有利于机体抵抗LPS致急性肝脏炎性损伤。结果表明，Zn可以显著增加野生型小鼠肝组织内MT含量，对敲除型小鼠肝组织内MT含量无影响。Zn预处理可以显著降低野生型小鼠血清酶升高趋势，可以有效减轻野生型小鼠肝组织病理损伤程度，减少细胞因子、NO等细胞毒性炎性介质的生成，减轻肝组织脂质过氧化损伤程度。Zn预处理对MT敲除型小鼠弱于野生型小鼠。上述结果进一步说明MT对LPS致肝脏损伤具有一定的保护效应，其可能作用机制与其影响细胞毒性炎性介质的生成以及直接清除致炎过程中生成的大量活性氧自由基有关。第二部分：Kupffer细胞及NF-κB在MT对LPS致肝脏炎症损伤保护效应中的作用采用KC特异性抑制剂氯化钆GdCl3，观察其对LPS引起的两种小鼠急性肝脏损伤的影响。将MT基因敲除小鼠（MT-／-）及与之对应的野生型小鼠（MT+／+）各分为4组：生理盐水对照组、LPS染毒组、GdCl3组、GdCl3预处理+LPS染毒组。动物腹腔注射LPS（10mg／kg）或生理盐水（NS），此前24h给予GdCl3（10mg／kg，i．v．）或NS预处理。注射LPS后24h测定镉饱和法测定肝脏金属硫蛋白（MT）含量，血清酶活力，进行肝组织病理学检查，检测一氧化氮（NO），细胞因子含量，检测肝组织脂质过氧化程度，判定不同处理对MT-／-小鼠及MT+／+小鼠肝脏的影响的差异。结果表明，氯化钆、LPS均可以诱导MT+／+小鼠肝脏MT生成。GdCl3预处理可以降低LPS对MT-／-小鼠及MT+／+小鼠血清中ALT，AST等酶活力，血清以及组织内NO、细胞因子含量的影响，可以减轻LPS对两种小鼠肝组织病理学损伤，有效减轻LPS对MT-／-小鼠及MT+／+小鼠引起的肝脏损伤，其可能机制与其对肝脏Kupffer细胞抑制作用有关。同时GdCl3预处理消除了LPS致两种基因型小鼠肝脏炎症反应之间的差异，提示MT发挥这种保护作用的可能途径是LPS与肝脏KC相互作用后的某个环节。采用NF-κB特异性抑制剂PDTC，观察NF-κB在MT保护LPS急性肝脏损伤中保护效应的作用，在注射LPS前30min，腹腔注射PDTC40mg／kg，LPS剂量为10mg／kg i．p．，作用24h后处死动物，结果观察到PDTC可以有效降低两种小鼠血清酶活性，减少血液中YNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子，血清以及肝脏组织中NO含量，降低肝组织TNF-α表达量，同时减轻两种小鼠肝脏组织病理学损伤程度，减轻肝组织内脂质过氧化产物生成量。既以PDTC预处理消除MT自由基清除作用对NF-κB转录活性的影响后，不能观察到两种小鼠NF-κB转录活性间的差异，其未见两种小鼠肝脏损伤程度的差异，提示MT可能通过其自由基清除作用调控NF-κB信号通路，从而影响整个炎症反应网络，造成了LPS致两种小鼠肝脏炎症损伤程度间的差异。

论文目录

• 英文缩写词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• （1）LPS的生物学特点及其危害
• （2）LPS致肝脏操作特点及其与主要信号转导途径的关系
• （3）金属硫蛋白对LPS诱发损伤的保护作用
• （4）本课题的目的、意义和主要内容
• 第一部分 对LPS致急性肝脏炎性损伤的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 Kupffer细胞及NF-κB在MT对LPS致肝脏炎症损伤保护效应中的作用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 文献综述
• 致谢