洛伐他汀产生菌的选育

论文摘要

洛伐他汀（lovastatin,也称莫那可林K,monacolin K）是一种来源于微生物HMG-CoA（羟甲基戊二酰辅酶A）还原酶抑制剂,是用于治疗高胆固醇症的药物,它能阻止动脉硬化发展,减少心肌梗塞等发病的危险,因此在医学上具有重要意义。目前美国和日本等国家已开发出一系列的他汀类药物,但我国对降脂红曲霉的研究还相对落后,生产中普遍存在产量偏低、生产成本偏高等问题。究其原因,一方面是培养工艺的不足,另一方面是优良菌株的缺乏。因而进行洛伐他汀产生菌的选育具有重大意义。洛伐他汀的主要产生菌为土曲霉（Aspergillus terreus）和红曲霉（Monascusspp.）。红曲霉不仅产生洛伐他汀,而且产生monacolin J、L、X,这些物质都是HMG-CoA还原酶抑制剂,具有很强的降低胆固醇功能。而且红曲色素作为一种天然色素,在我国广泛应用于清酒、酱油、腐乳、豆酱、鱼、肉、糕点等食品的着色。同时土曲霉是现在国内生产洛伐他汀的原始出发菌,它具有优良的发酵性能、较高的洛伐他汀产生能力、成熟的发酵工艺。原生质体融合技术是现代菌种选育技术之一,它有可能实现隐性基因的重组暴露,使一些隐性基因表达或随机产生新的基因表型,且与一般基因重组方法不同,不需遗传标记,对改良生产菌株性能可能更有效。本研究将通过土曲霉和红曲霉灭活原生质体融合技术,将土曲霉生产菌优良的发酵性能、较高的洛伐他汀产生能力、成熟的发酵工艺和红曲霉他汀类化合物的结构多样性、色素产生能力以及长期实践证明的安全性结合起来,选育洛伐他汀高产菌株。研究目的将具有较高洛伐他汀产生能力的土曲霉和具有他汀类化合物结构多样性的红曲霉原生质体融合在一起使其发生基因重组,通过灭活原生质体法初步筛选融合子,再通过洛伐他汀产量测定筛选高产洛伐他汀的融合子,并对目的融合子进行传代培养以确保其遗传稳定性。研究方法对土曲霉与红曲霉的生长曲线和洛伐他汀产生曲线进行探讨,研究红曲霉色素形成的曲线;考察不同酶解时间对原生质体制备与再生的影响,确定紫外线灭活原生质体的时间;比较紫外分光光度法和高效液相色谱法测定洛伐他汀含量的差异,确定洛伐他汀的定量方法;筛选高产洛伐他汀融合子,对其进行了生长特性研究,并传代确定其遗传稳定性。研究结果1.土曲霉摇瓶培养第3天为对数生长期,第7～8天洛伐他汀增长最快;红曲霉摇瓶培养第2天为对数生长期,第5～7天洛伐他汀增长最快。红曲色素在前9天缓慢增长,到第10天开始迅速增长。2.土曲霉和红曲霉用混合酶液分别酶解5小时和3.5小时制得的原生质体较多,再生率较高,加石英砂效果更好。土曲霉和红曲霉原生质体在紫外线（30cm,20W）下分别照射5min和4min可100%灭活。3.建立了两种对洛伐他汀的定量分析方法。一是高效液相色谱法（HPLC）,二是紫外分光光度法。实验表明HPLC法在0～50μg/ml浓度范围内对积分面积与洛伐他汀具有良好的线性关系,y=44813x-1330.6,R2=1;而使用紫外分光光度法,洛伐他汀含量与OD值亦呈线性关系,y=0.0952x+0.1093,R2=0.9773,精确度稍差,但可达到本实验的筛选目的。4.本实验在87株融合子中筛选得到27株洛伐他汀产量高于出发菌株的稳定融合子,其中有7株产量的提高幅度超过100%,并对其进行了生长特性研究。结论本实验利用灭活原生质体融合方法成功选育出洛伐他汀高产菌株,为工业上高产洛伐他汀菌株的选育提供理论依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 研究背景
• 1.2 研究目的
• 1.3 研究内容
• 2 菌株的培养
• 2.1 材料和仪器
• 2.2 实验方法
• 2.3 实验结果
• 2.4 讨论
• 3 洛伐他汀测定方法
• 3.1 材料和仪器
• 3.2 实验方法
• 3.3 实验结果
• 3.4 讨论
• 4 出发菌株土曲霉和红曲霉生长特性的研究
• 4.1 材料和仪器
• 4.2 实验方法
• 4.3 实验结果
• 4.4 讨论
• 5 原生质体的制备、灭活、再生与融合实验
• 5.1 材料和仪器
• 5.2 实验方法
• 5.3 实验结果
• 5.4 讨论
• 6 融合子筛选
• 6.1 材料和仪器
• 6.2 实验方法
• 6.3 实验结果
• 6.4 讨论
• 总结与展望
• 参考文献
• 附录 I 缩写词中英文对照
• 附录 II 在读期间科研情况及奖励
• 致谢