瑞氏木霉pyrG基因缺陷型菌株筛选以及GnTI和VHb基因表达研究

论文摘要

丝状真菌作为微生物具有结构简单、生长迅速、操作简便的优点，同时作为低等真核生物，又具有真核基因表达机器和真核蛋白质翻译后修饰加工装置，具有与哺乳动物系统相似的蛋白修饰性能。在发酵工业中，丝状真菌通常用于大规模生产酶制剂、有机酸等产物，其中有些菌株胞外酶产量可达20～40g/L。因此近年来丝状真菌分子生物学逐渐成为现代分子生物学研究的一个热点。最近已开始对丝状真菌的糖基化途径进行改造，以期得到能够产生与哺乳动物糖基化形式相近的工程菌株。 瑞氏木霉（Trichoderma reesei）是一种无性繁殖的丝状真菌，通常用于纤维素酶、半纤维素酶的生产。分子生物学证据显示瑞氏木霉是子囊菌Hyporcea jecorina的无性繁殖系。瑞氏木霉具有典型的真核蛋白修饰特性和理想的蛋白分泌能力。近年来，瑞氏木霉已作为基因工程宿主菌用于生产外源真核蛋白，并且为了生产药用人源蛋白而进行遗传改造，如其N-糖基化路径的人源化改造。 为了利用pyrG基因选择标记进行T．reesei转化，本文工作首先利用紫外线诱变技术获得了一株T．reesei pyrG基因缺陷菌株M23。M23在不含尿嘧啶核苷酸的培养基上无法生长，而转化含有pyrG基因的质粒后便可以在无尿嘧啶核苷酸的培养基上生长。转化率约为每微克质粒200～300个转化子。 本文利用T．reesei cbhl启动子和终止子构建了人N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅰ基因的真菌表达载体pCGNT，然后将在构巢曲霉trpC启动子和终止子控制下的透明颤菌血红蛋白（VHb）表达盒插入其中，构建了表达载体pUCGV。 用pUCGV质粒与pAN7-1质粒共转化T．reesei菌株U4，从含有150 mg/L潮霉素的平板上挑出约70个转化子。同时用pUCGV质粒与pAB4-1质粒共转化T．reesei菌株M23，从不含Uridine的平板上挑出约60个转化子。 PCR进行分子验证，得到一株GnTI和VHb基因稳定遗传的转化子T108。Southren Blot分析显示GnTI和VHb基因整合到T108染色体上。RT-PCR和SDS-PAGE分析表明GnTI和VHb基因在T108中已经转录并翻译。虽然使用CO差光谱法检测VHb的活性结果不明显，但是生长曲线显示在低氧条件下T108的生长速度高于出发菌株M23约10％。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 丝状真菌的转化系统
• 1.2.1 丝状真菌转化方法
• 1.2.2 选择标记
• 1.2.3 丝状真菌的表达载体
• 1.2.4 转化DNA的整合
• 1.3 透明颤菌血红蛋白概述
• 1.3.1 透明颤菌血红蛋白研究进展
• 1.3.2 VHb基因组成及VHb蛋白的结构
• 1.3.3 VHb的生理功能
• 1.3.4 VHb的应用及前景
• 1.4 重组糖蛋白的生产及表达宿主的选择与改造
• 1.4.1 糖蛋白概述
• 1.4.2 重组人源糖蛋白的生产
• 1.4.3 真菌表达系统糖基化途径改造进展
• 1.5 本文主要研究内容
• 第二章 T.reesei pyrG基因缺陷株的筛选
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 培养基及培养条件
• 2.1.4 90％紫外线致死照射剂量的确定
• 2.1.5 菌株的紫外线诱变
• 2.1.6 Uridine依赖突变株筛选
• 2.1.7 T.reesei Uridine依赖突变株的转化
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 紫外线对孢子的90％致死照射剂量
• 2.2.2 Uridine依赖突变株的筛选
• 2.2.3 Uridine依赖突变株的转化验证
• 2.3 本章小节
• 第三章 VHb和人GnTI在T.reesei中的表达研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 培养基及培养条件
• 3.1.4 重组DNA技术
• 3.1.5 重组质粒pCGNT和pUCGV的构建
• 3.1.6 pAB4-1和pUCGV共转化T.reesei
• 3.1.7 T.reesei潮霉素抗性转化法
• 3.1.8 pAN7-1和pUCGV共转化T.reesei
• 3.1.9 T.reesei转化子孢子的收集和保存
• 3.1.10 T.reesei染色体DNA的提取与纯化
• 3.1.11 转化子的PCR验证
• 3.1.12 转化子的Dot Blot和Southern Blot杂交分析
• 3.1.13 转化子的RT-PCR分析
• 3.1.14 T.reesei胞内蛋白SDS-PAGE电泳
• 3.1.15 CO差光谱法分析VHb活性
• 3.1.16 T.reesei低氧环境生长曲线分析
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 表达载体的构建
• 3.2.2 T.reesei转化
• 3.2.3 PCR方法挑选T.reesei阳性转化子
• 3.2.4 Dot Blot和Southern Blot杂交分析
• 3.2.5 转化子的RT-PCR验证
• 3.2.6 转化子胞内总蛋白SDS-PAGE分析
• 3.2.7 CO差光谱法分析VHb活性
• 3.2.8 转化子在低氧环境下的生长分析
• 3.3 本章小节
• 第四章 整合型共表达载体的构建及转化实验
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌株和质粒
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 培养基及培养条件
• 4.1.4 重组DNA技术
• 4.1.5 重组质粒pUCNV的构建
• 4.1.6 pUCNV转化T.reesei
• 4.1.7 T.reesei转化子孢子的收集和保存
• 4.1.8 PCR检测
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 pUCNV的构建及验证
• 4.2.2 pUCNV转化T.reesei
• 4.2.3 转化子的筛选与验证
• 4.3 本章小节
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表主要文章