体细胞杂交创建表达高抗白叶枯病基因的水稻新种质

论文题目: 体细胞杂交创建表达高抗白叶枯病基因的水稻新种质

论文类型: 博士论文

论文专业: 细胞生物学

作者: 严成其

导师: 钱凯先,吴平,薛刚平

关键词: 疣粒野生稻,栽培稻,原生质体融合,高抗白叶枯病

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 疣粒野生稻（Oryza mcycriana）是我国现存的有自主知识产权的三种野生稻之一,它对白叶枯病的抗性高抗接近免疫,抗性持久,是最理想的抗病育种材料。由于它与栽培稻分属为同的种,用常规的有性杂交方法难以打破生殖隔离。 通过疣粒野生稻与栽培稻原生质体融合研究,试图通过不对称融合途径,实现疣粒野生稻的遗传物质向栽培稻转变,获得体细胞种间杂种再生植株。1.进行了栽培稻大粒香、疣粒野生稻的愈伤组织诱导和对非胚性愈伤组织的状态 调控,使非胚性愈伤组织向着胚性方向转化。2.建立了疣粒野生稻、栽培稻大粒香的胚性悬浮细胞系。不同基因型的愈伤组织 在悬浮系建立过程中,对AA培养基的适应性不同,在悬浮培养的不同时期, 悬浮细胞的结构发生变化,理想的悬浮细胞系表现为细胞结构松散,细胞质 浓,颜色微黄,生长迅速。3.研究取得了疣粒野生稻与栽培稻的不对称融合参数,失活栽培稻细胞质采用 2.5（?）mol/L IOA处理15分钟,疣粒野生稻的细胞核钝化采用软X射线处理, 电压22OV,电流3mA,时间60min,剂量强度为3.55x10?拉特。4.采用PEG化学融合法获得了大粒香与疣粒野生稻不对称体细胞杂交的再生植株 共95株融合植株。5.对融合再生植株的形态进行了观察,融合植株形态表现明显偏向栽培稻,也具 有野生稻的特性。叶片长度和生长的形式似野生稻,叶宽介于两个亲本之间。6.对疣粒野生和大粒香的体细胞杂交D3代132份材料进行检测验证,已获得了 6份材料高抗白叶枯病的新种质（3级以下）,中抗的有27份（4级以下9 份,5级以下18份）。7.同时我们将再次检测的抗性较好的D3代12份材料进行RAPD,PCR AFLP的分 子检测,结果表明体细胞杂交后代电泳条带与亲本疣粒野生稻和栽培稻的条带 相符,证明是疣粒野生稻与大粒香的融合杂种。8.采用AFLP、RAPD、毛线管电泳技术分析体细胞杂交获得的新种质,经测序和 基因功能分析初步确认来源于疣粒野生稻的遗传物顷（DNA片段）分布水稻 第2号第4号第6号和第12染色体上。9.将抗性等综合性状较好的体细胞杂交材料进行了6代的选育。从F1代选育获 33份;F2代选育获36份;F3代选育获124份;F4代选育获67份:F5代选 育获126份;F6代种植130份株系。10.再生植株选育后代利用。在选育过程中,对一些株型好,穗型大,剑叶挺, 抗性好的材料及时利用。先后用于常规晚粳稻及杂交晚粳的选育,有二份材料 测产,平均产量达602.4公斤,比浙江省晚粳主栽品种宁67高出5.6%

论文目录:

摘要

Abstract

本研究创新点

第一部分 文献综述

1、植物原生质体技术的发展

2、植物原生质体技术的研究意义

2.1 细胞和遗传理论研究的好材料

2.2 植物育种中的意义

2.3 遗传转化的意义

3、以原生质体和细胞为受体的植物基因转化系统

3.1 原生质体的遗传转化

3.1.1 基因枪法

3.1.2 电击法

3.1.3 低压脉冲电泳介导基因转化

3.1.4 PEG介导的转化法

3.1.5 花粉管通道法

3.1.6 微针注射法

3.1.7 农杆菌介导的转化法

4.原生质体融合

4.1 植物原生质体融合技术的发展

4.2 水稻原生质体培养及融合的概况

5.野生稻的分类、分布、染色体及有利性状

5.1 野生稻的分类与染色体数

5.2 野生稻的分布与有利性状

第二部分 研究目的和设计思路

1.研究目的

2.设计思路

第三部分 材料与方法

1.实验材料

2.实验方法

2.1 胚性愈伤组织的诱导和继代

2.2 胚性悬浮细胞系的建立

2.3 原生质体的游离及培养

2.4 疣粒野生稻与栽培稻的原生质体融合及培养

2.5 融合体再生植株的形态观察：

2.6 融合体再生植株的RAPD分子检测：

2.7 融合体的毛细管电泳检测

2.7.1 毛细管电泳的缓冲溶液

2.7.1.1 缓冲溶液的选择

2.7.1.2 缓冲液的浓度

2.7.1.3 缓冲液pH对分离的影响

2.7.1.4 毛细管电泳的温度效应

2.7.2 水稻品种的毛细管电泳鉴定

2.8 亲本和融合体再生植株后代的AFLP检测

2.8.1 DNA提取

2.8.2 基因组DNA限制性酶切

2.8.3 接头的连接

2.8.4 预扩增

2.8.5 选择性扩增

2.8.6 配制测序胶

2.8.7 测序胶电泳

2.8.8.测序胶银染

2.9 来于野生稻的DNA片段克隆

2.9.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞制备及质粒转化

2.9.2 质粒抽提

2.10 来于野生稻的DNA片段[MegaBACE1000测序仪]测序

2.10.1 样品制备

2.10.2 样品的纯化：

2.10.3 测序仪上样及测序

2.11 序列比较和基因功能分析及染色体初定位

2.12 融合体再生植株的抗白叶枯病鉴定

2.13 融合体的再生植株的选育与利用

第四部分 结果和讨论

1.试验结果

1.1 胚性愈伤组织的诱导

1.2 胚性悬浮细胞系的建立

1.3 原生质体的培养

1.4 原生质体的融合体系的建立

1.4.1 原生质体的失活处理及融合

1.4.2 融合体的筛选及培养

1.5 融合体再生植株的形态观察

1.6 融合体再生植株的RAPD分子检测

1.7 融合体再生植株的毛细管电泳检测

1.8 亲体和体细胞杂交后代的AFLP鉴定

1.9 来于野生稻条带的DNA片段克隆测序

1.10 融合再生植株的抗白叶枯病鉴定

1.11 体细胞杂交再生植株后代的选育与利用。

2.讨论

2.1 胚性愈伤的诱导与胚状体的形成

2.2 水稻原生质体培养的技术体系

2.3 原生质体融合

2.4 细胞分裂与细胞分化

2.5 体细胞杂交材料的利用

2.6 亲本和体细胞后代的AFLP鉴定

3、进一步的研究展望

五、参考文献References

附录1：缩写及中英文对照

附录2:在攻读博士学位期间发表撰写 的学术论文、著作和专利

致谢

发布时间: 2005-10-10

参考文献

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