来源于Bispora betulina和Nesterenkonia xinjiangensis的木聚糖酶基因克隆、表达及性质研究

论文摘要

木聚糖是一种结构复杂的多聚五碳糖分子,需要多种酶的协同作用才能完全降解。而木聚糖酶能够水解木聚糖主链的β-1,4-糖苷键,是木聚糖降解酶体系中最关键的水解酶。由于木聚糖酶在工业上的重要应用,因而对木聚糖酶的研究越来越受到关注。而选择从极端环境中筛选产酶菌株,并从中筛选到具备优良性质的酶,是目前重要的研究手段之一。本研究以真菌Bispora betulina及嗜碱细菌Nesterenkonia xinjiangensis为实验材料,分别用加入桦木木聚糖、燕麦木聚糖或麸皮与玉米芯的培养基对实验菌株进行诱导产酶实验。经酶活力测定,这两株菌均能在诱导下产胞外木聚糖酶。通过对木聚糖酶基因的序列分析,分别从真菌B. betulina和嗜碱细菌N.xinjiangensis中克隆得到了两个GH11木聚糖酶基因Xyn11BB与xyn11NX,通过BLAST比对分析：Xyn11BB和xyn11NX与已报道的木聚糖酶的序列的一致性均不超过70%,这表明两个基因均具有一定的新颖性。将Xyn11BB与xyn11NX分别在毕赤酵母和大肠杆菌中进行了表达,在摇床水平上重组后的木聚糖酶表达量分别为121.15和65.5 U/mL,从而验证了基因的功能。对重组木聚糖酶rXyn11BB及rXyn11NX分别进行了纯化及酶学性质研究。其中重组酶rXyn11BB的最适pH是4.5,在pH 4.0-10.0的范围内有良好的pH稳定性,最适温度是50℃；rXyn11BB的比活为470U/mg, Km为113.06 mg/mL, Vmax为303.03μmol·min-1mg-1；它对胶原蛋白酶和胰蛋白酶及α-糜蛋白酶具有良好的抗性。而重组酶rXyn11NX的最适pH为7.0,在中性和碱性条件下有良好的pH稳定性；最适温度为55℃,此酶具有很好的热稳定性,在70℃下保温60 min后能保留近60%的剩余酶活,甚至在90℃下保温15 min后酶活还能保留40%以上。rXyn11NX的比活为2158 U/mg,Km为16.08mg/mL,Vmax为45.66μmol·min-1mg-1。同时重组酶rXyn11NX没有纤维素酶活性,这些特点使rXyn11NX在工业上尤其是造纸业有良好的应用前景。综合酶学性质表明二者可作工业应用及科学研究的良好材料。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 木聚糖及其结构
• 1.2 木聚糖酶的分子生物学
• 1.2.1 木聚糖酶的分子结构域
• 1.2.2 木聚糖酶的理化性质
• 1.2.3 木聚糖酶的家族
• 1.2.4 木聚糖酶的催化机制
• 1.2.5 木聚糖酶的诱导性
• 1.3 木聚糖酶的应用
• 1.3.1 在饲料行业中的应用
• 1.3.2 在制浆造纸行业中的应用
• 1.3.3 在酿酒行业中的应用
• 1.3.4 在食品行业中的应用
• 1.3.5 在其他方面的应用
• 1.4 立题依据及研究目的
• 第二章 来源于真菌Bispora betulina的木聚糖酶的基因克隆
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 引物设计、合成与核酸序列测定
• 2.1.3 试剂盒、酶与生化试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 培养基与溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 B.betulina产木聚糖酶能力验证
• 2.2.2 提取B.betulina的基因组DNA
• 2.2.3 设计简并引物
• 2.2.4 木聚糖酶基因片段的克隆
• 2.2.5 通过TAIL-PCR获得完整基因
• 2.2.6 分析获得的完整序列
• 2.2.7 提取B.betulina的总RNA
• 2.2.8 木聚糖酶基因cDNA的克隆
• 2.2.9 比较木聚糖酶cDNA序列的相似性
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 B.betulina产木聚糖酶能力验证
• 2.3.2 简并引物的设计
• 2.3.3 木聚糖酶基因片段的克隆
• 2.3.4 木聚糖酶完整基因的克隆与分析
• 2.3.5 木聚糖酶基因cDNA的克隆
• 2.3.6 木聚糖酶基因序列的分析
• 2.4 讨论与小结
• 第三章 木聚糖酶基因Xyn11BB在毕赤酵母中的表达纯化及酶学性质研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株与质粒
• 3.1.2 引物设计、合成与核酸序列测定
• 3.1.3 试剂盒、酶与生化试剂
• 3.1.4 主要仪器
• 3.1.5 培养基与溶液
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 构建重组表达载体pPIC9-Xyn11BB
• 3.2.2 重组载体电击转化毕赤酵母
• 3.2.3 测定木聚糖酶活力
• 3.2.4 木聚糖酶基因Xyn11BB在毕赤酵母中的表达
• 3.2.5 重组木聚糖酶rXyn11BB的纯化
• 3.2.6 重组木聚糖酶rXyn11BB的质谱鉴定
• 3.2.7 重组木聚糖酶rXyn11BB的酶学性质研究
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 构建毕赤酵母重组表达载体
• 3.3.2 重组载体电击转化毕赤酵母
• 3.3.3 绘制木糖的标准曲线
• 3.3.4 木聚糖酶基因Xyn11BB在毕赤酵母中的表达
• 3.3.5 重组木聚糖酶rXyn11BB的纯化
• 3.3.6 重组木聚糖酶rXyn11BB的质谱鉴定
• 3.3.7 重组木聚糖酶rXyn11BB的酶学性质研究
• 3.4 讨论与小结
• 第四章 来源于嗜碱细菌Nesterenkonia xinjiangensis木聚糖酶的基因克隆
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌株与质粒
• 4.1.2 引物设计、合成与核酸序列测定
• 4.1.3 试剂盒、酶与生化试剂
• 4.1.4 主要仪器
• 4.1.5 培养基与溶液
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 N.xinjiangensis产木聚糖酶能力验证
• 4.2.2 提取N.xinjiangensis的基因组DNA
• 4.2.3 设计简并引物
• 4.2.4 木聚糖酶基因片段的克隆
• 4.2.5 通过TAIL-PCR获得完整基因
• 4.2.6 分析获得的完整序列
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 N.xinjiangensis产木聚糖酶能力验证
• 4.3.2 简并引物的设计
• 4.3.3 木聚糖酶基因片段的克隆
• 4.3.4 木聚糖酶完整基因的克隆
• 4.3.5 木聚糖酶基因序列的分析
• 4.4 讨论与小结
• 第五章 木聚糖酶基因xyn11NX在大肠杆菌中的表达纯化及酶学性质研究
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 菌株与质粒
• 5.1.2 引物设计、合成与核酸序列测定
• 5.1.3 试剂盒、酶与生化试剂
• 5.1.4 主要仪器
• 5.1.5 培养基与溶液
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 构建重组表达载体pET-22b（+）-xyn11NX
• 5.2.2 重组载体电击转化大肠杆菌
• 5.2.3 木聚糖酶基因xyn11NX在大肠杆菌中的表达
• 5.2.4 重组木聚糖酶rXyn11NX的纯化
• 5.2.5 重组木聚糖酶rXyn11NX的质谱鉴定
• 5.2.6 重组木聚糖酶rXyn11NX的酶学性质研究
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 去除xyn11NX的信号肽编码序列
• 5.3.2 构建重组表达载体pET-22b（+）-xyn11NX
• 5.3.3 木聚糖酶基因xyn11NX在大肠杆菌中的表达
• 5.3.4 重组木聚糖酶rXyn11NX的纯化
• 5.3.5 重组木聚糖酶rXyn11NX的质谱鉴定
• 5.3.6 重组木聚糖酶rXyn11NX的酶学性质研究
• 5.4 讨论与小结
• 第六章 全文结论
• 参考文献
• 硕士期间发表的论文
• 致谢