极耐热性β-葡萄糖苷酶的高效表达及其在生产栀子蓝色素中的应用

论文摘要

天然栀子蓝色素的转化是在β-葡萄糖苷酶的作用下将栀子苷的糖苷键水解后再与氨基酸聚合而成,β-葡萄糖苷酶在转化过程中起着至关重要的作用。本实验使用一种新型热激载体pHsh克隆了来源于嗜热菌属的海栖热袍菌β一葡萄糖苷酶基因。构建重组质粒pHsh-bglA-WT并分别转化入不同的大肠杆菌宿主细胞BL21 Codon plus （DE3）-RIL和DHIOB,在DH10B中的比酶活为6.4U/mg,在BL21 Codon plus（DE3）-RIL中比酶活达25.7U/mg,是前者的4倍左右,且是可溶性表达。为了进一步提高表达量,接着对重组质粒pHsh-bglA-WT进行了改造,通过反向PCR,改变部分载体序列和部分基因序列,优化mRNA的二级结构,使核糖体结合位点释放出来,减少在翻译过程中核糖体与SD序列结合的空间位阻,得到重组质粒pHsh-bglA-M,同样将该质粒电转化入大肠杆菌BL21Codon plus （DE3）-RIL和DHIOB中,在大肠杆菌DHIOB中的比酶活为88.5U/mg,在BL21 Codon plus （DE3）-RIL中的比酶活为107.1U/mg,是前者的1.2倍。因此,通过优化表达最终实现了耐热性葡萄糖苷酶在重组菌BL21 Codon plus （DE3）-RIL中的高水平可溶性表达,比酶活最高达107.1U/mg。以重组菌BL21 Codon plus （DE3）-RIL/pHsh-bglA-M作为种子液,采用TB培养基在25L的二联体发酵罐中进行中试化放大生产。根据本实验室申请的专利——导罐诱导技术,诱导表达重组蛋白。发酵结束后,发酵液经离心收集细胞,重组蛋白产量可达17834U/L。收集的重组菌经磷酸盐缓冲重悬,采用高压破碎的方式破细胞,得到的粗酶液经70℃,25min的热处理和DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析柱后,经SDS-PAGE检测获得了条带单一的纯酶。蛋白分子量大小与理论一致,比酶活为1746.2U/mg,纯化倍数为16.2,得率为17.5%。栀子天然蓝色素的生产：以提取的栀子苷和初级氨基酸为原料,加入葡萄糖苷酶,在80℃条件下孵育3h,在不同的反应体系下,可分别获得天然蓝色素和紫色素。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1 食用天然色素
• 1.1 食用天然色素的发展
• 1.2 食用天然色素现状
• 1.3 食用天然色素的发展方针与展望
• 2 栀子
• 2.1 栀子简介
• 2.2 栀子系列色素
• 2.3 栀子黄色素
• 2.4 栀子蓝色素
• 2.5 天然蓝色素的来源
• 2.6 栀子蓝色素的呈色机理
• 2.7 栀子蓝色素的理化性质
• 3 研究背景与研究内容
• 3.1 研究背景
• 3.2 研究内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种与质粒
• 2.1.2 培养基配方
• 2.1.3 主要试剂及其来源
• 2.1.4 主要仪器设备及其来源
• 2.1.5 DNA引物合成和DNA测序服务
• 2.2 方法
• 2.2.1 海栖热袍菌的培养
• 2.2.2 海栖热袍菌基因组DNA的提取
• 2.2.3 感受态细胞的制备
• 2.2.4 电转化
• 2.2.5 胶回收DNA片断
• 2.2.6 酶切、连接、磷酸化反应及乙醇沉淀
• 2.2.7 质粒抽提
• 2.2.8 重组β-葡萄糖苷酶的构建
• 2.2.8.1 引物设计
• 2.2.8.2 基因扩增
• 2.2.8.3 质粒构建与酶切验证
• 2.2.9 重组质粒二级结构的优化
• 2.2.9.1 引物设计
• 2.2.9.2 PCR扩增
• 2.2.9.3 质粒构建与验证
• 2.2.10 重组菌的诱导表达
• 2.2.10.1 诱导时机
• 2.2.10.2 诱导时间
• 2.2.11 中试放大生产重组蛋白
• 2.2.11.1 菌种的准备
• 2.2.11.2 设备的使用
• 2.2.11.2.1 NB型空气过滤器消毒
• 2.2.11.2.2 设备空消
• 2.2.11.2.3 培养基实消
• 2.2.11.3 发酵生产
• 2.2.12 重组质粒在不同宿主细胞中的表达
• 2.2.13 酶活的测定
• 2.2.14 重组蛋白的纯化
• 2.2.14.1 粗酶液的制备
• 2.2.14.2 热处理
• 2.2.14.3 阴离子交换层析柱
• 2.2.14.4 硫酸铵沉淀
• 2.2.14.5 透析
• 2.2.15 蛋白浓度的测定
• 2.2.15.1 试剂配方
• 2.2.15.2 制作标准曲线
• 2.2.16 SDS-PAGE
• 2.2.16.1 溶液配制
• 2.2.16.2 胶的制作
• 2.2.17 栀子蓝色素的转化
• 2.2.17.1 底物栀子苷的用量优化
• 2.2.17.2 甘氨酸的用量优化
• 2.2.17.3 重组蛋白的用量优化
• 2.2.17.4 色价的测定
• 第三章 结果
• 3.1 质粒的构建与酶切验证
• 3.2 重组蛋白在不同宿主中的表达
• 3.3 重组蛋白的纯化
• 3.4 诱导条件对重组蛋白表达的影响
• 3.4.1 诱导时机
• 3.4.2 中试放大生产
• 3.5 色素的转化
• 3.5.1 底物栀子苷的量
• 3.5.2 甘氨酸的量
• 3.5.3 重组蛋白的量
• 3.5.4 色价的测定
• 第四章 讨论
• 4.1 耐热性β-葡萄糖苷酶
• 4.2 重组蛋白的表达
• 4.3 重组蛋白的纯化
• 4.4 色素的转化
• 主要结论
• 全文主要创新点
• 参考文献
• 致谢