嗜水气单胞菌毒力基因及基因工程疫苗

论文摘要

本研究对嗜水气单胞菌的毒力与毒力基因分布的相关性进行了研究。克隆了嗜水气单胞菌菌株A. hydrophila XS91-4-1的气溶素基因（aerA）的全序列。进而原核表达出有活性的重组气溶素蛋白。用该重组蛋白分离血液中的锥虫,对该重组蛋白的应用进行了初步的探讨。为该毒素今后深入的应用研究打下基础;另一方面,分析了气溶素蛋白抗原表位的分布,并对基于该毒素蛋白的基因工程亚单位疫苗和核酸疫苗进行了研究。为今后发展和研制有效的嗜水气单胞菌基因工程亚单位多联疫苗和核酸多联疫苗奠定了基础。嗜水气单胞菌毒力与毒力基因分布的相关性研究,采用PCR方法对我国九株鱼源嗜水气单胞菌编码气溶素、溶血素、胞外丝氨酸蛋白酶的3种毒力基因进行扩增,分析3种基因在不同菌株间的分布情况,并比较了它们对异育银鲫毒力的差异。结果发现ahpA阴性菌株为无毒株,强毒株呈aerA+hlyA+ahpA+基因型。本研究首次发现ahpA阳性的嗜水气单胞菌皆为毒力菌株,并且发现aerA和ahpA基因与嗜水气单胞菌的毒力存在相关性。克隆了嗜水气单胞菌菌株A. hydrophila XS91-4-1气溶素基因aerA的基因全序列。比较分析了20株不同来源的气单胞菌属菌株气溶素的氨基酸序列,发现气单胞菌属气溶素分为三大类:嗜水气单胞菌类、豚鼠气单胞菌类和温和气单胞菌类,相似性分别为94-99%、79-83%和66-70%。此外,比较发现所有分析菌株气溶素存在两处非常保守的区域,分别为139-153aa处（SYLAHYLGYAWVGG）和342-352aa处（GFLRWGGNAW）,可以通过该保

论文目录

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• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 嗜水气单胞菌与细菌性败血症
• 2 嗜水气单胞菌的形态特征与培养特性
• 3 嗜水气单胞菌的分类地位
• 4 血清型
• 5 宿主范围、分布及流行
• 6 症状及病理
• 7 毒力机制
• 7.1 胞外产物外毒素
• 7.1.1 气溶素
• 7.1.1.1 气溶素通道的性质
• 7.1.1.2 毒素的结构特征
• 7.1.1.3 毒素的作用机理
• 7.1.1.4 气溶素的应用
• 7.1.1.5 气溶素基因
• 7.1.2 溶血素HlyA
• 7.1.3 胞外蛋白酶
• 7.2 细菌表面物质和内毒素
• 7.2.1 S 层
• 7.2.1.1 S 层蛋白性质
• 7.2.1.2 S 层相关基因
• 7.2.1.3 S 层蛋白的分泌
• 7.2.1.4 S 层的功能
• 7.2.2 脂多糖
• 7.2.3 4-型鞭毛
• 7.3 转铁机制
• 8 感染
• 9 嗜水气单胞菌的诊断
• 10 嗜水气单胞菌鱼类免疫防治现状
• 10.1 疫苗免疫
• 10.1.1 全菌疫苗
• 10.1.2 亚单位疫苗
• 10.1.3 基因工程疫苗
• 10.1.3.1 基因工程亚单位疫苗
• 10.1.3.2 基因缺失苗或突变苗
• 10.1.3.3 核酸疫苗
• 第二章 嗜水气单胞菌毒力与毒力基因的相关性
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 PCR 检测
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 基因组DNA 的提取
• 2.2.3 PCR 反应
• 2.2.4 PCR 反应产物电泳、回收和测序
• 2.3 不同A. hydrophila 菌株对鲫鱼的致病性
• 2.3.1 细菌数的测定
• 2.3.2 对鲫鱼的毒力试验
• 3 结果
• 3.1 三种毒力基因PCR 扩增电泳结果
• 3.2 序列测定
• 3.3 对异育银鲫致死性
• 4 讨论
• 第三章 嗜水气单胞菌气溶素aerA 基因的分子克隆
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 基因组DNA 全长的获得
• 2.3 染色体步行的方法获得气溶素基因（aerA）的全序列
• 3 结果
• 3.1 aerA 基因的克隆
• 3.2 aerA 基因的序列特点
• 4 讨论
• 第四章 气溶素基因原核表达、活性检测及其应用的初步分析
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 主要仪器设备
• 2.2 主要试剂
• 2.3 表达载体的构建
• 2.4 重组嗜水气单胞菌气溶素aerA 基因的诱导表达
• 2.5 表达产物的鉴定
• 2.6 亲和层析纯化表达的蛋白
• 2.6.1 天然条件下纯化可溶性目的蛋白
• 2.6.2 变性条件下纯化包涵体形式的目的蛋白
• 2.7 重组气溶素蛋白的溶血活性的鉴定
• 2.8 变性重组气溶素蛋白的复性
• 2.8.1 变性条件下，重组蛋白AerA-W 在琼脂中的复性
• 2.8.2 变性蛋白的透析复性
• 2.8.3 活性检测
• 2.9 应用重组气溶素蛋白分离血液中锥虫
• 3 结果
• 3.1 嗜水气单胞菌aerA 基因在大肠杆菌中的表达及表达条件优化
• 3.2 重组蛋白AerA-W 的变性及非变性条件下的纯化
• 3.3 变性重组气溶素蛋白的复性
• 3.4 应用重组气溶素蛋白分离血液中的锥虫
• 4 讨论
• 4.1 用pET-32a 载体成功地表达了嗜水气单胞菌气溶素aerA 基因
• 4.2 影响蛋白可溶性的因素
• 4.2.1 合适的载体和宿主菌组合
• 4.2.2 表达条件的优化
• 4.2.3 与蛋白序列有关
• 4.3 重组蛋白AerA-W 的溶血活性的检测
• 4.4 重组蛋白AerA-W 包涵体复性的可行性分析
• 4.5 重组气溶素蛋白成功地分离血液中的锥虫
• 第五章 嗜水气单胞菌气溶素蛋白抗原决定簇的分析
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 气溶素氨基酸序列分析
• 2.3 表达载体的构建及鉴定
• 2.4 重组载体的诱导表达
• 2.5 表达产物的鉴定
• 2.6 亲和层析纯化表达的重组蛋白
• 2.7 蛋白浓度的测定
• 2.8 Dot-blot 免疫印迹
• 3 结果
• 3.1 气溶素氨基酸序列分析
• 3.2 气溶素各部分在大肠杆菌中的表达及SDS-PAGE 分析
• 3.3 天然条件或变性条件下AerA-A 和AerA-M 纯化
• 3.4 Dot-blot 免疫印迹
• 4 讨论
• 第六章 基因工程疫苗的研究
• 第一节 气溶素基因工程亚单位疫苗
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 目的蛋白的切胶回收
• 2.3 兔多克隆抗体的制备
• 2.4 Western 免疫印迹Dot-blot 免疫印迹
• 3 结果与讨论
• 第二节 气溶素APT 区域核酸疫苗的构建及免疫
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 气溶素APT 区域核酸疫苗的构建
• 2.3 质粒的大量提取及定量
• 2.4 鱼类免疫接种
• 2.5 ELISA 检测程序
• 2.6 Western-blot 分析
• 2.7 攻毒试验
• 3 结果与讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢