猪卵丘细胞核移植研究

论文摘要

体细胞核移植是一项复杂的胚胎工程技术,该技术操作环节过多是影响其总效率的一个重要因素,简化和规范化体细胞核移植操作程序是提高核移植效果的重要途径。本实验以猪卵丘细胞为供核细胞,对猪卵丘细胞核移植操作过程中的卵母细胞去核方法、核移植方式、核质作用时间以及其相关问题,如卵母细胞体外成熟培养等进行了研究,旨在探索一种适用于猪体细胞核移植的简单易行的供体细胞获得方法、去核方法、核移植方式、核质作用时间等操作技术。根据对实验数据的分析,得到以下几点结论: 1、猪体细胞核移植受体卵母细胞体外成熟培养研究:以改良的TCM199为基础培养液,以第一极体排出作为猪卵母细胞成熟标志,研究不同级别猪卵丘细胞-卵母细胞复合体（COCs）和不同培养基添加物对猪卵母细胞体外成熟培养效果的影响。结果表明: （1）卵母细胞分级培养时,A级（253/324,78.09%）、B级COCs（520/689,75.47%）的COCs体外成熟率明显高于C级COCs（37/137,64.03%）和不分级混合培养（794/1240,27.01%）,差异显著（P<0.05）。 （2）以改良TCM199为基础培养液,分别添加10%猪卵泡液（490/1139,43.02%）、10%发情猪血清（599/1426,42.00%）于对照组（改良的TCMl99基础培养液,607/1264,48.02%）相比,体外成熟率差异不显著（P>0.05）;两个实验组之间没有明显差异（P>0.05）。 （3）以改良TCM199为基础培养液,分别添加10%发情牛血清（1027/1397,73.51%）、10ng/mlEGF（1040/1368,76.02%）于对照组（607/1264,48.02%）相比,卵母细胞体外成熟率明显提高,差异显著（P<0.05）;两个实验组之间没有明显差异（P>0.05）。 实验结果表明,对猪体细胞核移植受体卵母细胞的体外成熟培养,以培养前分级处理和在改良TCM199基础培养液中添加10%发情牛血清或10ng/mlEGF成熟效果较好。 2、猪卵丘细胞核移植研究:以猪卵丘细胞作为供核细胞,用电激活法激活卵母细胞,比较了卵丘细胞获得方法、受体卵母细胞去核方法、重建胚构建方法对猪卵丘细胞核移植效果的影响。结果表明: （1）卵丘细胞获得方法对猪核移植效果影响:本实验获取作为供核细胞的猪卵丘细胞方法有两种。其一,直接从成熟卵母细胞周围分离得到卵丘细胞;其二,卵丘细胞经过体外培养传代4代的卵丘细胞,以重建胚早期发育率为指标,比较了两种供核细胞对猪核移植效果的影响。结果表明:以这两种方法获得的供核细胞形成重建胚的卵裂率（37.76%（37/98）/38.93%（51/131））、4-8细胞率（12.24%（12/98）/12.2105（16/131））及桑椹胚率（2.04%（2/98）/1.53%（2/131））均无显著差异（P>0.05）。因此,直接从成熟卵母细胞周围分离得到卵丘细胞可以作为核供体进行核移植,使操作程序简化。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 文献综述
• 1.动物细胞核移植技术研究的历史与现状
• 2.动物细胞核移植的操作程序
• 2.1.MⅡ期卵母细胞的去核
• 2.1.1.盲吸去核法
• 2.1.2.活性荧光染料染色去核法
• 2.1.3.半卵去核法
• 2.1.4.微分干涉和极性显微镜去核法
• 2.1.5.功能性去核法
• 2.1.6.化学试剂去核法
• 2.1.7.末期去核法
• 2.1.8.蔗糖去核法
• 2.2.供核细胞的准备
• 2.2.1.关于供核细胞的种类问题
• 2.2.2.关于供核细胞的来源问题
• 2.2.3.关于供核细胞细胞周期与受体卵母细胞胞质状态的协调问题
• 2.2.4.核移植胚胎的重构（供核细胞的移植）
• 2.2.5.供核细胞与受体卵母细胞的融合
• 2.2.6.重建胚的激活
• 2.2.7.核移植重建胚的培养
• 3.影响核移植效率的因素
• 3.1.受体卵母细胞质
• 3.2.供核细胞的来源和所处的细胞周期
• 3.3.受体卵母细胞的去核
• 4.体细胞核移植技术的应用前景
• 4.1.扩大优良种畜或稀有动物的数量
• 4.2.生产转基因动物
• 4.3.生产胚胎干细胞用于细胞和组织的代替疗法
• 4.4.肿瘤和癌细胞基因活动规律的研究
• 5.细胞核移植技术存在的问题
• 5.1.核移植的总效率很低
• 5.2.后代存活率低
• 5.3.线粒体DNA（mDNA）问题
• 6.本实验研究的目的和意义
• 实验部分
• 第一部分：材料与用具
• 1.主要仪器、器具及主要试剂
• 1.1.主要仪器、器具
• 1.2.主要试剂
• 1.3.主要器具的制备
• 1.3.1.固定管的制备
• 1.3.2.去核针的制备
• 1.3.3.注核针的制备
• 2.本试验涉及的培养液
• 2.1.猪胚胎体外培养液NCSU-23
• 2.2.猪卵母细胞体外成熟基础培养基（改良TCM199）
• 2.3.洗卵液及抽卵液
• 2.3.1.洗卵液
• 2.3.2.抽卵液
• 2.3.3.融合液
• 2.3.4.显微操作液
• 2.4.发情牛（猪）血清的制备
• 2.5.猪卵泡液的制备
• 第二部分：实验方法与实验设计
• 1.试验方法
• 1.1.猪卵母细胞的收集及体外成熟（IVM）
• 1.2.猪卵丘细胞的分离与培养
• 1.3.去核、移核操作
• 1.3.1.盲吸法
• 1.3.2.活性荧光染色去核法
• 1.3.3.盲吸法和活性荧光染色法联合去核法
• 1.4.供核体细胞与受体卵母细胞的融合
• 1.5.核移植后的重建胚激活
• 1.6.核移胚的培养和体外发育
• 2. 实验设计
• 2.1 不同级别猪卵母细胞对体外成熟的影晌
• 2.2.不同培养基添加物对猪卵母细胞体外成熟影晌
• 2.3.培养的卯丘细胞和直接分离的卵丘细胞对猪体细胞核移植的影响
• 2.4.不同去核方法对猪卵母细胞的去核效果
• 2.5.不同移核方式对猪体细胞核移植效果的影响
• 2.6.核质作用时间对猪体细胞核移植效果的影响
• 第三部分:实验结果和分析
• 3.1.不同级别猪卵母细胞对体外成熟的影响
• 3.2.不同培养基添加物对猪卵母细胞体外成熟影响
• 3.3.培养传代的卵丘细胞和直接分离的卵丘细胞对猪体细胞核移植的影响
• 3.4.不同去核方法对猪卵母细胞的去核效果
• 3.5.不同移核方式对猪体细胞核移植效果的影响
• 3.6.核质作用时间对猪体细胞核移植效果的影响
• 第四部分:讨论
• 4.1.不同级别猪卵母细胞体外成熟效果
• 4.2.不同培养基添加物对猪卵母细胞体外成熟的影响
• 4.3.培养的卵丘细胞和直接分离的卵丘细胞对猪体细胞核移植的影响
• 4.4.不同去核方法对猪卵母细胞去核效果的影响
• 4.5.不同移核方式对猪体细胞核移植效果的影响
• 4.6.核质作用时间对猪体细胞核移植效果的影响
• 第五部分:结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 发表文章