超声场下基因/模式药物输送及生物学效应的实验研究

论文摘要

近年来,随着超声技术的发展、应用以及微泡造影剂研制的进展,超声与微泡造影剂的协同作用在基因治疗、药物输送、溶栓治栓、炎症和肿瘤的靶向显影与治疗等医学领域显示了巨大的应用潜力,逐渐成为医学领域研究中的一个热点。本研究选用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）、HeLa细胞作为离体细胞模型,以EGFP基因作为外源目的基因、核酸荧光染料TO-PROTM-1、PI、DAPI作为模式药物,分别通过MTT比色分析法、倒置荧光显微镜观察法、流式细胞检测技术、MGG染色法、考马斯亮蓝染色法研究了20 kHz低频超声单独和与微泡造影剂联合介导EGFP基因转染内皮细胞、HeLa细胞的效率和规律、超声与脂质体共同介导EGFP基因转染HeLa细胞的效率和规律、超声介导模式药物输送的效率和规律以及超声对血管内皮细胞增殖活性、生长曲线、迁移能力和细胞骨架的影响。研究结果表明:1. 20 kHz低频超声能介导EGFP基因转染人脐静脉内皮细胞和HeLa细胞,但转染率较低,一般在0.2%2%之间;细胞类型对转染率有影响,HeLa细胞的转染率要高于内皮细胞的转染效率;质粒浓度对转染效率有影响,在一定范围内质粒浓度越高转染效率越大;2.超声与脂质体共同介导EGFP基因转染HeLa细胞,虽然转染效率随超照射时间的增加而降低,但转染率却随超声照射时间的增加而增加,这可能与脂质体对细胞的毒性有关;3.超声联合微泡能明显增强EGFP基因转染内皮细胞和HeLa细胞,转染效率增加平均约34倍,最高分别3.5倍和4.6倍;然而,微泡在一定程度上也会增强超声对细胞的损伤;4.超声介导模式药物的输送效率较高,但输送效率与超声介导基因转染的规律略有所不同:随超声照射时间的增加,转染效率先增加,在6秒时取得最大,随后逐渐下降;而药物的输送效率是在9秒时取得最大,随后下降;5.过量的超声辐射会抑制细胞增殖活性,使生长曲线变得更加平缓,显著降低细胞的迁移能力,使骨架结构发生分解、变小,结构变得松散,排列失去有序性,甚至发生断裂;也会使细胞胞质减少,发生明显回缩。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 超声造影剂介绍
• 1.2 超声与超声造影剂的联合运用
• 1.2.1 基因治疗
• 1.2.2 药物输送
• 1.2.3 溶栓治疗
• 1.2.4 炎症靶向显影
• 1.2.5 肿瘤治疗
• 1.3 低频超声的生物学效应
• 1.4 本文创新之处
• 第二章 低频超声联合微泡造影剂介导基因转染的体外实验研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 细胞
• 2.1.2 主要试剂及溶液配制
• 2.1.3 主要实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 质粒的转化、扩增、提取和鉴定
• 2.2.2 细胞培养与鉴定
• 2.2.3 超声装置及超声照射参数
• 2.2.4 实验分组与转染步骤
• 2.2.4.1 质粒+超声组
• 2.2.4.2 脂质体+超声组
• 2.2.4.3 微泡+超声组
• 2.2.5 超声照射后细胞增殖活性的测定
• 2.2.6 倒置荧光显微镜下定性观察EGFP 基因的转染、表达
• 2.2.7 流式细胞仪定量检测EGFP 基因的转染效率
• 2.2.8 数据处理
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 质粒的酶切鉴定
• 2.3.2 内皮细胞的培养与鉴定
• 2.3.3 HeLa 细胞培养
• 2.3.4 MTT 比色法检测超声对细胞增殖活性的影响
• 2.3.5 单纯超声照射组EGFP 基因的表达
• 2.3.6 超声与脂质体共同介导的对 HeLa 细胞的转染的研究
• 2.3.6.1 脂质体+超声共同介导EGFP 基因在HeLa 细胞中的表达
• 2.3.6.2 脂质体与超声共同介导的EGFP 基因对HeLa 细胞的转染效率
• 2.3.7 微泡+超声组对转染效率的影响
• 2.3.7.1 不同微泡浓度对超声介导的EGFP 基因转染效率的影响
• 2.3.7.2 微泡（10%）对超声介导的EGFP 基因转染效率的影响
• 2.4 讨论
• 第三章 超声介导的模式药物输送
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 细胞
• 3.1.2 主要试剂及其配制
• 3.1.3 主要实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 细胞培养
• 3.2.2 实验分组与步骤
• 3.2.3 MTT 比色法检测超声对细胞增殖活性的影响
• 3.2.4 荧光倒置显微镜下定性观察导入效率
• 3.2.5 流式细胞仪定量检测导入效率
• 3.2.6 数据处理
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 超声对内皮细胞增殖活性的影响
• 3.3.2 模式药物导入效率的定性观察
• TM-1 模式药物的输送效率'>3.3.3 TO-PRO^TM-1 模式药物的输送效率
• 3.4 讨论
• 第四章 超声对内皮细胞的生物学效应的实验研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 细胞
• 4.1.2 主要试剂及溶液配制
• 4.1.3 主要实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 MTT 比色法检测超声对 HUVECs 增殖的影响
• 4.2.2 Millicell 小室检测超声对人脐静脉内皮细胞迁移能力的影响
• 4.2.3 考马斯亮蓝染色法显示超声照射对内皮细胞骨架的影响
• 4.2.4 统计学分析
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 超声照射对 HUVECs 增殖的影响
• 4.3.2 Millicell 小室检测超声照射对内皮细胞迁移能力的影响
• 4.3.3 超声照射对 HUVECs 的细胞骨架的影响
• 4.4 讨论
• 第五章 总结与展望
• 5.1 总结
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻硕期间取得的研究成果