番茄青枯病拮抗菌筛选鉴定及发酵条件研究

论文摘要

番茄青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种毁灭性土传病害,其防治一直是世界性的难题。本试验针对广东省诱发青枯病的两株主要青枯菌SST-Y和G2M1.70,从健康番茄根系采集土壤样品,分离筛选出对番茄青枯菌具有良好抑菌活性的土著微生物,对其培养基和发酵条件进行优化,初步研究了拮抗菌抗菌物质稳定性和抗菌范围,并通过盆栽试验验证其对番茄青枯病的防治效果,为今后应用于实践提供科学依据,从而使番茄青枯病得到更有效的防治。试验从不同地点的番茄根系土壤分离微生物,采用平板对峙方法筛选番茄青枯病拮抗菌。每个地点随机采集9株健康番茄根系0～20 cm深度的土壤样品,分离得到284株菌株,其中33株对番茄青枯菌具有抑菌活性。经双层平板法复筛获得4株（YB1, YB6, YB22, YB70）对SST-Y和G2M1.70均具有较强抑菌活性的菌株,其中YB6在牛肉膏蛋白胨培养基上抑菌圈直径>17 mm,抑菌活性最强。将4株拮抗菌连续继代培养10次发现只有YB6拮抗效果稳定,因此本试验选取YB6作为试验对象。YB6经传统鉴定确定为节杆菌属（Arthrobacter）细菌。节杆菌广泛存在于土壤中,少见关于其对拮抗番茄青枯菌的报道。通过单因素试验和正交试验进行发酵条件研究,最佳培养基组成和发酵工艺参数为:以1.5%蔗糖为碳源,0.6%酵母浸膏、1.0%蛋白胨及0.3%硫酸铵为氮源, pH 9.0的发酵培养基中,3%接种量, 30°C,100 r/min恒温连续震荡培养3 d。该发酵条件下YB6抑菌活性明显增强,YB6对SST-Y和G2M1.70抑菌圈直径与初始发酵条件相比分别增加了76.72%和81.14%。在不同物理、化学条件下研究抗菌物质稳定性,结果表明:YB6化学稳定性较弱,对pH和蛋白酶K敏感,pH小于6大于10条件下和1.5 mg/mL以上浓度蛋白酶K均会使其活性显著下降;物理稳定性中对热较敏感,在60°C及其以上温度失去抑菌活性,紫外线照射5 h和35000 L光照条件下均十分稳定。YB6培养液和YB6无菌上清液分别在4°C和常温条件下保存,结果显示,培养液和无菌上清液常温保存抑菌活性均要好于4°C保存,并且在4°C和常温下前者抑菌活性好于后者。YB6固体菌剂吸附载体的研究表明:从菌体吸附量、存活率和抑菌活性综合分析,有机肥、玉米粉、花生饼粉、草炭、稻杆粉和米糠有机载体吸附效果好于活性碳和蛭石无机载体,其中玉米粉为载体时菌体吸附量最大,存活率最高,抑菌活性最好。YB6盆栽试验防治效果研究表明,在番茄幼苗移栽时分别以泡种、浇注、灌根、蘸根方式接种YB6,其中以蘸根方式接种效果最好,其防治率达到65.0%,效果显著。YB6抗菌范围试验结果表明,该菌株对水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani Kuhn）、甘蔗黑粉病菌（Ustilago scitaminea Syd.）、柑橘炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers.）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cubense）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzea）、水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas compeatris pv. oryzicola） 8种供试病原菌均有抑制效果,说明YB6具有较广的抑菌作用,其中对甘蔗黑粉病和小麦赤霉病抑制效果较强,抑菌率分别达到88.6%和80.2%,说明YB6作为生防菌具有较大的开发潜力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 引言
• 1.1 番茄青枯病概述
• 1.2 番茄青枯菌致病机理
• 1.3 番茄青枯病的防治方法及现状
• 1.3.1 抗病品种选育
• 1.3.2 化学防治
• 1.3.3 农业防治
• 1.3.4 生物防治
• 1.4 拮抗菌产生抗菌物质的种类
• 1.4.1 细菌素类物质
• 1.4.2 抗生素及次生代谢产物
• 1.5 拮抗菌发酵条件优化
• 1.5.1 培养条件优化
• 1.5.2 发酵培养基优化
• 1.6 番茄青枯病防治问题与展望
• 1.7 课题来源及研究内容
• 1.7.1 课题来源
• 1.7.2 研究内容、目的及意义
• 1.8 技术路线
• 2. 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试病原菌
• 2.1.2 样品来源
• 2.1.3 培养基配方
• 2.1.4 主要试剂和药品
• 2.1.5 仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 番茄根系微生物的分离纯化
• 2.2.2 番茄青枯病拮抗菌的筛选
• 2.2.3 拮抗菌鉴定
• 2.2.4 拮抗菌发酵条件优化
• 2.2.5 抗菌物质粗提液稳定性研究
• 2.2.6 保存时间对抑菌活性的影响
• 2.2.7 拮抗菌固体菌剂吸附载体研究
• 2.2.8 拮抗菌盆栽试验
• 2.2.9 拮抗菌抗菌范围研究
• 3. 结果与分析
• 3.1 番茄根系微生物的分离纯化
• 3.2 番茄青枯病拮抗菌的筛选
• 3.2.1 番茄青枯菌致病力检测
• 3.2.2 拮抗菌初筛结果
• 3.2.3 拮抗菌复筛结果
• 3.2.4 拮抗菌稳定性测定
• 3.3 拮抗菌的鉴定
• 3.3.1 YB6 生长曲线的测定
• 3.3.2 菌体形态特征及生理生化鉴定结果
• 3.4 拮抗菌发酵条件优化
• 3.4.1 发酵条件研究
• 3.4.2 正交试验优化发酵培养基结果
• 3.5 抗菌物质粗提液稳定性研究
• 3.5.1 物理稳定性
• 3.5.2 化学稳定性
• 3.6 保存时间对抑菌活性影响
• 3.6.1 拮抗菌培养液
• 3.6.2 拮抗菌无菌上清液
• 3.7 拮抗菌固体菌剂吸附载体研究
• 3.7.1 载体吸菌量测定
• 3.7.2 不同时间各载体的菌体存活率
• 3.7.3 不同时间各载体菌剂抑菌活性的变化
• 3.8 拮抗菌盆栽试验防治效果
• 3.9 拮抗菌抗菌范围试验结果
• 4. 讨论
• 4.1 拮抗菌的筛选与鉴定
• 4.2 拮抗菌发酵条件优化
• 4.3 抗菌物质稳定性研究
• 4.4 吸附载体研究
• 4.5 盆栽试验
• 4.6 抗菌范围试验
• 5. 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文