真姬菇融合育种中木素氧化酶系转化体系的建立及机理初探

论文摘要

真姬菇又名斑玉蕈,蟹味菇,隶属伞菌目,口蘑科,玉蕈属。由于其出菇周期长、生物学效率低、易受霉菌污染等问题,在一定程度上限制了其规模化生产。本研究通过对真姬菇采用酶学与原生质体融合技术相结合的方法,从而提高真姬菇对原材料的利用率,加强其抑制杂菌能力和缩短出菇周期。首先,通过对32种食用菌品种进行木素氧化酶系定性定量检测,筛选出大杯蕈（鲁）,同时以真姬菇9602作为实验材料,将高温灭活的大杯蕈（鲁）原生质体与真姬菇9602原生质体融合,建立真姬菇育种中木素氧化酶系转化体系。通过RB-PDA平板显色技术和苯胺蓝平板显色技术,筛选出具有木素氧化酶系活性较高的四个融合菌株ⅠM1、ⅡM1、ⅢM3和IIIM5。再次,融合菌种ⅠM1、ⅡM1、ⅢM3和IIIM5与两亲本的形态学特性比较发现, IM1和IIIM5类似真姬菇具有明显的锁状联合和典型的双核多细胞且菌丝直径比较细；四个融合菌株与两亲本间有明显的拮抗线,四个融合菌株之间也存在拮抗线。RAPD-PCR和ISSR-PCR扩增结果显示,ⅠM1, ⅢM5不仅具有与两亲本相同的条带,而且出现了新的条带,但两融合菌株与真姬菇的相似性较高,亲缘关系更近,且两融合菌株之间也存在差异,而ⅡM1、ⅢM3与真姬菇条带相同。通过对四个融合菌株进行鉴定,进一步筛选出新的融合菌株IM1和IIIM5。最后,IM1和IIIM5的生物学特性结果表明,两个融合菌株菌丝最适生长温度24℃。IM1和IIIM5最适酸碱度与大杯蕈相同,在PDA平板上最适pH 8.0,在栽培料中,最适生石灰量为2%。真姬菇最适酸碱度,在PDA中最pH值为7.0,在栽培料中,最适生石灰量1%。同时发现,Ca2+可以促进菌丝的生长。添加碳源、氮源和离子对融合菌株和两亲本菌丝生长速度和菌丝形态影响较大,其中以葡萄糖为碳源,牛肉膏为氮源和以K：Mg（2：1）为离子组合时,融合菌株和真姬菇菌丝生长都很快且菌丝洁白浓密。融合菌株最在栽培料中适含水量为60%-65%。IMI和IIIM5的生物学效率分别比真姬菇提高了14.58%和4.67%,同时IM1,出菇周期缩短4-6天且出菇整齐,‘商品性状明显优于真姬菇,表现出良好的生产应用价值,而融合菌株IIM1生物学效率低于真姬菇,只有17.28%,说明由于融合随机性既可以出现生产性状好的菌株也可能出现生产性状差的菌株。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1 木素氧化酶系概述
• 1.1 木素氧化酶系简介
• 1.2 木素氧化酶系分类
• 1.2.1 木质素过氧化物酶（Lip）
• 1.2.2 锰过氧化物酶（MnP）
• 1.2.3 漆酶（Lac）
• 1.3 木素氧化酶系的应用前景
• 1.3.1 对芳香污染物的降解
• 1.3.2 染料类化合物的降解
• 1.3.3 造纸废水的处理
• 2 真姬菇的概述
• 2.1 真姬菇的简介
• 2.2 真姬菇的生物学特性
• 2.2.1 真姬菇的形态
• 2.2.2 真姬菇子实体发育过程
• 2.3 真姬菇的价值
• 2.3.1 真姬菇的营养价值
• 2.3.2 真姬菇的药用价值
• 2.4 真姬菇的生活条件
• 2.4.1 温度
• 2.4.2 湿度
• 2.4.3 空气
• 2.4.4 营养
• 2.4.5 光照
• 2.4.6 酸碱度
• 3 大杯蕈的概述
• 3.1 大杯蕈的简介
• 3.2 大杯蕈生物学特性
• 3.2.1 大杯蕈形态特征
• 3.2.2 大杯蕈子实体发育过程
• 3.3 大杯蕈的价值
• 3.3.1 大杯蕈的营养价值
• 3.3.2 大杯蕈的药用价值
• 3.4 大杯蕈的生活条件
• 3.4.1 营养
• 3.4.2 温度
• 3.4.3 光照
• 3.4.4 空气
• 3.4.5 酸碱度
• 3.4.6 湿度
• 4 食用菌原生质体融合育种的研究
• 4.1 原生质体融合育种方法的研究
• 4.1.1 化学法
• 4.1.2 物理法
• 4.2 融合菌株的筛选方法研究
• 4.2.1 利用营养缺陷型标记筛选融合子
• 4.2.2 利用抗药性标记筛选融合子
• 4.2.3 利用荧光染色法筛选融合子
• 4.2.4 利用灭活原生质体标记筛选融合子
• 4.2.5 双亲对碳源利用不同而筛选融合子
• 4.3 融合菌株的鉴定方法
• 4.3.1 生物学鉴定法
• 4.3.2 生化鉴定
• 4.3.3 同工酶电泳图谱
• 4.3.4 分子生物学方法
• 5 本课题研究的目的和意义
• 第一章 不同类型食用菌产木素氧化酶系能力比较与分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试菌种
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 试剂及仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 菌种活化
• 1.2.2 粗酶液制备
• 1.2.3 RB亮蓝平板定性检测漆酶（Lac）
• 1.2.4 苯胺蓝平板定性检测过氧化物酶（Lip+MnP）
• 1.2.5 亚甲基蓝（MB）法定性检测木质素过氧化物酶（Lip）
• 1.2.6 愈创木酚法定性检测锰过氧化物酶（MnP）
• 1.2.7 ABTS法定量测定漆酶（Lac）活性
• 1.2.8 菌丝生长速度的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 木素氧化酶系的检测与测定
• 2.2 菌丝生长速度的测定
• 3 结论
• 第二章 真姬菇与大杯蕈原生质体融合
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 培养基
• 1.1.2 供试菌株
• 1.1.3 试剂及仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 菌丝的培养与制备
• 1.2.2 原生质体的制备与观察
• 1.2.3 原生质体热灭活处理
• 1.2.4 原生质体诱导融合及再生培养
• 1.2.5 融合菌株的挑选
• 1.2.6 融合菌株的筛选
• 2 结果与分析
• 2.1 真姬菇9602与大杯蕈（鲁）的原生质体形态及得率
• 2.2 原生质体热灭活结果
• 2.3 原生质体融合及再生培养
• 2.4 融合菌株的挑选
• 2.5 融合菌株的筛选
• 3 结论
• 第三章 生物学方法及分子生物学方法鉴定融合菌株
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 试剂及仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 供试菌株的活化
• 1.2.2 融合菌株生物学鉴定
• 1.2.3 融合菌株分子生物学鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 菌丝锁状联合及细胞核显微观察
• 2.2 拮抗试验结果
• 2.3 RAPD分析结果
• 2.4 ISSR分析结果
• 3 结论
• 第四章 融合菌株生物学特性测定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 供试培养基
• 1.1.3 仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 不同温度梯度在PDA上对菌丝生长的影响
• 1.2.2 不同碳源对菌丝生长的影响
• 1.2.3 不同氮源对菌丝生长的影响
• 1.2.4 不同金属离子组合对菌丝生长的影响
• 1.2.5 pH梯度试验
• 1.2.6 不同温度在栽培料中对菌丝生长的影响
• 1.2.7 栽培料中不同含水量对菌丝生长的影响
• 1.2.8 栽培料中不同生石灰含量对菌丝生长的影响
• 1.2.9 不同栽培料对菌丝生长的影响
• 1.2.10 出菇实验
• 2 结果分析
• 2.1 不同温度对融合菌株生长的影响
• 2.2 不同碳源对菌丝长势及生长速度的影响
• 2.3 不同氮源对菌丝长势及生长速度的影响
• 2.4 不同离子组合对菌丝长势及生长速度的影响
• 2.5 不同pH值对菌丝长势及生长速度的影响
• 2.6 不同温度在栽培料中对菌丝生长的影响
• 2.7 栽培料中不同含水量对菌丝生长的影响
• 2.8 栽培料中不同生石灰含量对菌丝生长的影响
• 2.9 不同栽培料对菌丝生长的影响
• 2.10 出菇实验
• 3 结论
• 参考文献
• 致谢