论文摘要
FSH是垂体分泌的糖蛋白激素,对雄性精子的产生有至关重要的作用。实验表明阻断FSH或受体活性可以引起少精或无精。人们利用FSH这种生物学功能结合免疫学的理论和方法研究开发FSH/FSHR避孕疫苗。就FSHR避孕疫苗而言,其是通过受体抗体结合间接封闭FSH的生物学功能,抑制精子的生成达到避孕的目的。FSHR是G蛋白偶联受体,有669氨基酸组成,其胞外区是与FSH结合的关键部位。为避免与其它糖蛋白家族发生交叉反应而干扰其它激素的功能,因此对FSHR活性的表位筛选具有重要意义。研究发现通过克隆技术表达的FSHR N端多肽(18~27、25~34、29~38氨基酸)可以避孕,而且生育力在停止免疫后逐渐恢复。以上研究无疑为避孕疫苗的研究带来了曙光。但也仍存在一些问题,如所应用的研究对象数目少,不具有代表性,生育力恢复实验仅为33.4%,其对生殖健康的远期影响尚需进一步的验证等。本实验室前期工作中用人FSHR重组蛋白免疫雄性小鼠后,导致小鼠受孕率明显下降。但一个严重的问题是带来生殖器管的损伤及睾酮的下降。考虑到FSHR蛋白免疫动物造成生殖器官损伤主要是因为蛋白表面含有多种表位,除中和表位外,其它表位如毒性表位、优势非中和性表位等可能引起免疫偏移造成免疫损伤,因此为了减少其副作用,我们利用计算机联合预测结合人工合成的方法获得关于FSHR蛋白胞外区由13氨基酸组成的多肽,并采用不同剂量多肽初免、加强策略免疫雄鼠,观察其避孕效应及对生殖机能的影响,主要内容包括:1.利用各种生物信息学方法对FSHR胞外区蛋白进行二维结构分析、对B细胞表位筛选以及通过分子对接等综合预测,获得优势中和表位肽段,并对获得的肽段进行优化。并通过肽结合实验进一步验证筛选肽段的免疫原性,获得最终优化后B细胞表位多肽。2.使用不同剂量的FHSR多肽免疫雄性小鼠,在不同的免疫时期与正常受孕的雌鼠合笼(比例1:2)观察雌鼠受孕率及产仔率。3.在观察不同剂量FSHR肽段对小鼠避孕效果同时,检测被免疫小鼠的生殖器官有无病理损害、了解被免疫小鼠的精子功能,以及性激素水平。主要采用的实验方法如下:1.采用DNAprotein软件对FSHR蛋白胞外区二级结构分析,抗原性方案、亲水性方案、可及性方案等对B细胞表位进行筛选以及通过分子对接等手段进行综合分析。经与前期获得的B细胞表位进行比较及优化后,获得最佳抗原表位肽段。2.用ELISA方法检测筛选肽段的免疫原性。2.根据预测结果,人工合成FSH受体胞外区肽段,与泛T细胞表位PDR偶联成融合蛋白,免疫小鼠。具体分组是:FSHR肽20ug及80ug两个剂量及对照组PBS、蛋白组共4组。采取肽初免、加强策略,初免与完全佐剂混合、加强免疫与不完全佐剂混合注射于成年雄性小鼠后肢足垫。3.ELISA方法观察免疫前及免疫后0、2、3、4、6、8、10、12、14、16、20周抗体滴度。4.受孕实验:根据抗体滴度,分别于免疫后6周(抗体滴度大于1:500)及10周(抗体滴度大于1:1000)按1:2与雌鼠合笼观察雌鼠受孕率及产仔率,进行统计学分析。5.初免结束后11周每组各取4只小鼠,检测附睾精子数、活力及畸形率。6.通过体外精卵结合实验了解精子功能。7.HE染色在光镜下观察有无生殖器官病理变化。电镜下观察血睾屏障。8.放免法测定被免疫小鼠血睾酮情况。所获得的实验结果:1.通过筛选、优化获得B细胞优势中和表位的肽段---IELRFVLTKLRVI。将获得的FSHR优势表位肽与泛T细胞表位---aKXVAAWTLKAAaZ偶联,获得FSHR融合肽。2.抗体滴度于初免后2周逐渐上升,肽组(80μg)在免疫后10周达到高峰,后逐渐下降。3.肽(20ug)小鼠雌鼠受孕率及产仔率与PBS对照组无区别;而肽(80ug)组及蛋白组小鼠在免疫10周雌鼠受孕率及产仔率下降,与PBS对照组相比有显著差异。4.在初免后11周在光镜及透射电镜下肽组生殖器官无病理损害,血睾屏障无破坏,血睾酮水平无变化,而蛋白组光镜下即有明显精原细胞水肿或点状坏死,睾酮下降。5.不同剂量FSHR肽及蛋白组免疫小鼠后均导致精子数减少,活力降低,精卵融合受抑制.肽(80ug)组及蛋白组的精子畸形率明显升高。根据以上结果,我们可以得知:不同剂量FSHR肽免疫小鼠后结果不同,肽(20ug)组雌小鼠受孕率及产仔率无改变,而肽(80ug)组雌小鼠受孕率及产仔率均下降,与蛋白组相似。虽然不同剂量FSHR肽均导致精子功能下降,但只有肽(80ug)组受孕率下降,因此说明精子功能只有下降到一定程度后才达到避孕效果。而且通过对免疫后生殖器官的观察,肽组即无对生殖器官病理损害,也无对睾酮产生影响。因此就FSHR多肽疫苗免疫小鼠后即可以避孕又对生殖器官无损伤及对性激素无影响而言,其具有成为潜在的理想的避孕疫苗的可能。
论文目录
相关论文文献
- [1].槟榔江水牛FSHR基因分离鉴定及其功能初步分析[J]. 云南农业大学学报(自然科学) 2018(06)
- [2].牦牛FSHR基因克隆及其在生殖轴中的表达研究[J]. 中国畜牧兽医 2019(02)
- [3].绵羊卵泡期卵泡颗粒细胞FSHR差异剪接体的表达[J]. 中国兽医学报 2019(08)
- [4].香猪FSHR基因外显子10的多态性及其与产仔数间的关联分析[J]. 中国畜牧兽医 2017(03)
- [5].绵羊FSHR基因生物信息学分析及其器官表达规律研究[J]. 黑龙江畜牧兽医 2019(03)
- [6].京海黄鸡FSHR基因组织表达谱及表达规律的研究[J]. 扬州大学学报(农业与生命科学版) 2019(03)
- [7].绵羊FSHR基因可变剪接体的克隆、鉴定及表达分析[J]. 江苏农业学报 2017(03)
- [8].雷州黄牛促卵泡素受体基因(FSHR)的多态性分析[J]. 广东畜牧兽医科技 2008(03)
- [9].FSHR在不同羊品种中的研究进展[J]. 安徽农学通报 2008(20)
- [10].卵泡刺激素受体FSHR234纳米抗体的分离纯化及多克隆抗体的制备[J]. 微生物学通报 2018(11)
- [11].鸡FSHR重组蛋白的异源表达及纯化制备[J]. 畜牧兽医科技信息 2017(07)
- [12].牦牛FSHR基因5′端部分序列克隆及生物信息学分析[J]. 家畜生态学报 2014(01)
- [13].鸡FSHR基因研究进展[J]. 畜牧兽医科技信息 2014(06)
- [14].卵泡刺激素受体(FSHR_(32-44))肽疫苗对雄性小鼠生殖器官影响[J]. 免疫学杂志 2012(09)
- [15].北极狐FSHR基因多态性与产仔数关联分析[J]. 黑龙江畜牧兽医 2014(11)
- [16].黄牛FSHR基因的生物信息学分析[J]. 甘肃农业大学学报 2012(04)
- [17].山羊FSHR基因编码蛋白的结构及功能分析[J]. 河南农业科学 2017(07)
- [18].FSHR基因多态性与绝经后骨质疏松症的关联性分析[J]. 中国骨质疏松杂志 2020(11)
- [19].转录因子PAX4调控湖羊FSHR基因转录活性[J]. 畜牧兽医学报 2018(05)
- [20].湖羊和巴什拜羊FSHR基因多态性分析[J]. 畜牧与兽医 2017(05)
- [21].牛FSHR基因第4外显子多态性检测及序列分析[J]. 中国兽医学报 2011(03)
- [22].水牛促卵泡素受体(FSHR)基因启动子克隆、生物信息学分析及转录活性检测[J]. 中国畜牧兽医 2015(11)
- [23].贵州地方山羊FSHR基因与繁殖性状的相关性研究[J]. 农业生物技术学报 2017(01)
- [24].FSHR基因多态性与卵巢早衰和多囊卵巢综合征的关系[J]. 广东医学 2016(01)
- [25].无量山乌骨鸡FSHR基因分离、表达及其蛋白功能分析[J]. 云南农业大学学报(自然科学) 2018(05)
- [26].小尾寒羊FSHR基因在生殖轴的表达研究[J]. 中国草食动物科学 2018(06)
- [27].卵泡刺激素受体在雌性山羊颈动脉体的分布[J]. 中国兽医学报 2017(05)
- [28].日粮不同能量水平对绵羊卵巢FSHR基因表达的影响[J]. 河北农业大学学报 2012(01)
- [29].卵泡刺激素受体(FSHR)胞外区B细胞表位的优化筛选[J]. 中国妇幼保健 2012(29)
- [30].德国牧羊犬FSHR基因第1外显子的克隆与序列分析[J]. 黑龙江畜牧兽医 2014(15)