水稻KCC基因的功能研究及盐芥小RNA的功能研究

论文摘要

盐胁迫是自然界中主要的非生物胁迫之一。阳离子运输体及植物体内阳离子的均衡对植物耐逆及生长发育具有非常重要的作用。因为K+和Na+对植物耐逆和营养方面具有非常重要的作用,所以K+和Na+运输体最近研究的比较广泛和深入。现在已经非常清楚,植物在盐胁迫条件下的适应能力与Cl-的均衡具有非常重要的关系,这不仅是因过多的Cl-积累在植物共质体能对植物产生毒害作用,更重要的是因为在大多数的盐性土壤中,Cl-是最重要的阴离子。Cl-能够改变K+和Na+的活性及其在植物组织和细胞间的分配。Cl-和K+一样,是高等植物内的一种非常重要的营养元素和渗透调节物质,在植物的渗透调节和细胞伸长方面具有非常重要的作用。在动物中,阳离子氯离子共转运体（CCC）家族在控制动物体内的渗透调节及K+、Na+和Cl-的均衡方面起着非常重要的作用。最近,在双子叶植物拟南芥中研究发现,拟南芥AtCCC基因在调节植物生长发育及离子均衡方面具有非常重要的作用。到目前为止,在单子叶植物中还没有关于阳离子氯离子共转运体参与植物营养及盐胁迫的分子方面的报道。本实验的主要目的是利用单子叶植物水稻为研究材料,对其阳离子氯离子共转运基因OsKCC进行研究,揭示其与水稻生长发育及耐盐性的关系。在世界范围内,非生物胁迫是引起农作物减产的最主要的原因。科学家们做了大量的工作来揭示植物复杂的胁迫响应机制,所做的工作主要集中在寻找和鉴定胁迫响应蛋白上。最近研究发现,除了蛋白之外,microRNAs （miRNAs）和small interfering RNAs （siRNAs）对植物胁迫响应也具有非常重要的作用。随后的研究发现小RNA对生物胁迫也具有很重要的作用。MiRNA和siRNA是一类小分子的非编码的RNA,能够介导mRNA的降解、抑制蛋白翻译和对基因组进行修饰。作为拟南芥近缘的盐芥,是很有前景的植物耐盐模式植物。本实验的主要目的是利用盐芥为研究材料,克隆盐芥的小RNA并研究其在盐芥耐逆方面的功能,揭示其与盐芥耐盐性的关系。本实验的主要结果如下:1、水稻OsKCC基因的克隆和功能分析1)根据动物中的阳离子氯离子共转运体的蛋白序列做blastp分析,发现在水稻中具有四个与其关系相近的阳离子氯离子共转运体。选择其中一个OsKCC基因设计引物,利用RT-PCR方法从水稻中克隆获得OsKCC基因的全长序列。该基因的开放阅读框全长为2970bp,共编码989个氨基酸,分子量约为109 KD。2)对该基因的序列特征做了详细的分析,发现OsKCC基因与已报道的植物比如拟南芥AtCCC基因同源性很高,与动物中的同源性较远,但它蛋白结构与动物及人中的KCC蛋白最为相似。用跨膜区预测软件分析发现其编码的氨基酸序列具有11个跨膜的结构域。3)对OsKCC基因在水稻不同部位及不同胁迫下的表达特性进行了详细的分析。Real-timePCR结果表明水稻根中OsKCC基因的表达量要比地上部分高,且均受NaCl和KCl诱导,KCl诱导OsKCC基因上升的程度比NaCl高。4)将OsKCC的开放读码框构建到植物表达载体pROKⅡ中,导入根癌农杆菌AGL1后,转化水稻。转基因水稻在含G418（40mg/L）的MS培养基上连续筛选,获得了32个纯合的T3代转OsKCC基因的植株。选用两个纯合的转基因株系进行分子验证和生理分析。PCR和real-time PCR证实OsKCC基因已整合进水稻基因组并正常的转录表达。生理测试分析表明在正常条件和NaCl及KCl胁迫下,转OsKCC基因的水稻植株与野生型植株差异不显著。5)构建了水稻OsKCC的GFP定位载体,转化水稻和洋葱表皮细胞。OsKCC蛋白在水稻及洋葱表皮细胞中的定位分析表明,OsKCC蛋白定位在植物细胞的细胞膜上。6)构建了OsKCC基因的沉默载体pROKⅡ-KCC:Ri,转化水稻。转基因水稻在含G418（40mg/L）的MS培养基上连续筛选,获得了18个纯合的T3代OsKCC基因沉默的植株。Real-time PCR证实了基因沉默水稻中OsKCC基因的表达量明显低于野生型对照。对基因沉默水稻的耐逆性分析表明OsKCC基因沉默后增加了基因沉默水稻的KCl和NaCl的敏感性。KCl和NaCl胁迫下与野生型对照相比基因沉默水稻的地上部分和根中的K+和Cl-含量都降低,Na+含量没有明显的差异。2、盐芥小RNA的克隆及功能研究1)构建了一个300 mM NaCl处理24小时的盐芥小RNA库,通过测序分析发现这个库内有22个miRNA,它们属于13个miRNA家族。2)构建了miR393、miR398和miR400的沉默表达载体,并转化了盐芥。3)克隆了ThSRO5和ThP5CDH基因间的DNA片段。分别克隆出了ThSRO5和ThP5CDH基因的3’非编码区,并克隆到了polyA位置。在盐芥中ThSRO5和ThP5CDH基因的3’端不存在反向互补,就不能像拟南芥那样产生可以降解P5CDH基因的SiRNA。4)盐芥中脯氨酸含量随着NaCl浓度的增加和处理时间的延长而逐步增加,在ABA、PEG、脯氨酸和4℃处理后盐芥体内脯氨酸含量也显著增加。Real-time PCR数据显示P5CS基因在各种胁迫处理后其表达量都上升,随着NaCl浓度的增加P5CS基因表达量也在增加。P5CDH基因在各种处理后表达量都上升,它的变化趋势和体内脯氨酸的变化趋势是比较一致的。SRO5基因在各种处理后表达量也上升,其变化趋势与P5CDH基因的变化趋势一致。本研究的主要创新点:1、首次对单子叶植物水稻的OsKCC基因进行较为详尽的研究,证明OsKCC是一个有功能的定位于细胞膜K+-Cl-共转运蛋白,能够介导K+和Cl-向细胞内转运。对OsKCC基因在不同胁迫下的表达特性进行了的分析。OsKCC基因沉默后增加了转基因水稻对NaCl和KCl的敏感性。基因沉默水稻在NaCl和KCl处理后体内的K+和Cl-含量下降。2、首次构建了盐芥的小RNA库,并克隆得到了22个miRNA。构建了3个胁迫相关miRNA的沉默载体。3、首次证明盐芥和拟南芥的脯氨酸在胁迫条件下变化趋势的不同是由siRNA的作用不同引起的。在盐芥中不存在降解P5CDH基因的siRNA。

论文目录

中文摘要

英文摘要

英文缩写符号及中英对照表

第一部分文献综述

1 阳离子转运与植物的耐逆性

<sup>+/H⁺ 逆向转运蛋白与植物的耐盐性'>1.1 Na^<sup>+/H⁺逆向转运蛋白与植物的耐盐性

+-ATPase 与植物的耐盐性'>1.2 Na⁺-ATPase 与植物的耐盐性

2+/H⁺ 逆向转运蛋白与植物的耐逆性'>1.3 Ca²⁺/H⁺逆向转运蛋白与植物的耐逆性

+/H⁺逆向转运蛋白与K⁺ 平衡'>1.4 K⁺/H⁺逆向转运蛋白与K⁺平衡

+内流与K⁺ 吸收'>1.5 Na⁺内流与K⁺吸收

+ 逆向转运蛋白'>1.6 其它Cation/H⁺逆向转运蛋白

1.7 小结

2 阳离子氯离子共转运体

2.1 动物中的阳离子氯离子共转运体

2.2 植物中的阳离子氯离子共转运体

3 盐芥——新型耐盐模式植物

3.1 盐芥作为新型耐盐模式植物的优势

3.2 盐芥耐盐的生理及分子生化研究

3.3 盐芥作为新型耐盐模式植物以后将要重点开展的研究

4 MicroRNA 研究进展

4.1 MicroRNA 产生过程

4.2 MicroRNA 的作用机制

4.3 植物中保守的miRNA

4.4 植物miRNA 的表达

4.5 耐逆相关的miRNA

5 脯氨酸与植物的耐逆性

5.1 脯氨酸的功能

5.2 植物体中脯氨酸的合成和降解途径

5.3 脯氨酸合成的关键酶—Δ1-二氢吡咯-5-羧酸合成酶

5.4 SiRNA 调控拟南芥中脯氨酸的降解

第二部分实验论文

第一章水稻KCC 基因的功能研究

一、实验材料、仪器及方法

1.1 植物材料

1.2 菌种及质粒

1.3 引物序列

1.4 酶及化学试剂

1.5 主要仪器设备

1.6 培养基

1.7 质粒提取液

2 实验方法

2.1 Trizol 试剂提取植物总RNA

2.2 反转录PCR 扩增

2.3 PCR 产物与T-载体的连接

2.4 大肠杆菌感受态的制备及转化

2.5 质粒的提取

2.6 PCR 及酶切验证水稻KCC 基因

2.7 测序验证水稻KCC 基因

2.8 水稻KCC 基因5’及3’全序列的拼接

2.9 水稻KCC 基因植物表达载体的构建

2.10 根癌农杆菌AGL1 感受态的制备及转化

2.11 农杆菌介导的水稻的转化

2.12 转基因水稻的分子检测

2.13 植物基因组DNA 的提取和Southern 杂交

2.14 转基因水稻的PCR 检测

2.15 植物总RNA 的提取

2.16 不同处理条件下水稻KCC 基因以及转基因水稻KCC 基因表达的Real-time PCR 分析

2.17 转基因水稻的遗传分析

2.18 过量表达及基因沉默水稻耐逆性分析

二、实验结果

1 水稻KCC 蛋白系统谱系分析

2 水稻KCC 蛋白Clustalx 分析及蛋白质结构域分析

3 水稻KCC 蛋白跨膜分析

4 水稻KCC 基因在不同胁迫条件下的特异性表达分析

5 水稻KCC 基因在水稻不同组织中的表达分析

6 水稻KCC 基因的克隆

7 水稻KCC 基因的测序及拼接

7.1 水稻KCC 基因5’片段的测序及拼接

7.2 水稻KCC 基因的测序及全长序列的拼接

8 植物表达载体的构建

8.1 过量表达载体

8.2 GFP 定位载体

8.3 基因沉默载体

9 农杆菌的转化

10 转基因水稻的遗传分析

10.1 水稻的转化及转基因水稻的筛选

10.2 转基因纯系植株的获得

10.3 水稻突变体的获得

11 转基因水稻的分子检测

11.1 过量表达OsKCC 基因水稻的PCR 鉴定

11.2 水稻KCC 蛋白GFP 定位水稻的PCR 鉴定

11.3 基因沉默OsKCC 水稻的PCR 鉴定

11.4 转基因水稻的Southern 杂交鉴定

11.5 转基因水稻的实时定量PCR 表达分析

12 水稻KCC 蛋白的定位

13 转基因水稻的耐盐性鉴定

13.1 NaCl 及KCl 对转基因水稻萌发力的影响

13.2 NaCl 及KCl 对转基因水稻生长的影响

13.3 盐处理对过量表达、基因沉默与野生型植株干、鲜重的影响

+、K⁺ 含量变化情况'>13.4 过量表达、基因沉默植株与野生型植株中Na⁺、K⁺含量变化情况

+、Na⁺ 相对含量变化情况'>13.5 过量表达、基因沉默植株与野生型植株中K⁺、Na⁺相对含量变化情况

13.6 过量表达、基因沉默植株与野生型植株中Cl- 含量变化情况

三、讨论

第二章盐芥小RNA 库的构建及其功能研究

一、实验材料、仪器及方法

1 实验材料、仪器

1.1 植物材料处理

1.2 质粒及菌种

1.3 化学试剂、主要仪器设备

1.4 试剂盒

1.5 引物序列

2 实验方法

2.1 Trizol 试剂提取植物总RNA 及异硫氰酸胍法提取总RNA

2.2 小分子RNA 的提取

2.3 小分子RNA 的聚丙烯酰胺凝胶分离

2.4 小分子RNA 的回收

2.5 小分子RNA 的克隆

2.6 反转录PCR 扩增及实时定量PCR

2.7 脯氨酸含量的测定

二、实验结果

1 盐芥小RNA 的提取及分离

2 盐芥小RNA 的克隆

3 小RNA 的测序及数据分析

3.1 不同大小的小RNA 出现的次数

3.2 小RNA 第一个碱基出现的频率

3.3 不同重复数的小RNA 的出现频率

3.4 MiRNA 前体的预测

3.5 MiRNA target 的预测

3.6 通过Blast 分析发现保守的miRNA

4 MiRNA 沉默载体的构建

4.1 拟南芥IP51 基因的克隆及沉默载体的构建

4.2 经过改造的沉默载体与相应的miRNA 的互补结构

5 盐芥中不存在调控脯氨酸降解的SiRNA

6 盐芥ThSR05 和ThP5CDH 间基因组序列的克隆

7 盐芥ThSR05 和ThP5CDH 基因3’polyA 位置的鉴定

8 不同胁迫处理对盐芥中脯氨酸含量的影响

9 不同胁迫处理对盐芥中ThP5CS、ThP5CDH 和ThSR05 基因含量的影响

三、讨论

图版

参考文献

致谢

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